基于Chimeric antigen receptor T cells (CAR-T)技術(shù)的細胞治療可謂是當下火熱的腫瘤治療方法之一,。與早期的基于T細胞的Adoptive cell transfer（ACT）不同,，CAR-T技術(shù)融入B細胞，也就是抗體的識別能力,。因此CAR-T能靶向MHC異常表達或不表達的腫瘤細胞,，并能作用于多數(shù)傳統(tǒng)ACT無法靶向的細胞膜表面靶點[1],。
CAR-T原理圖，來源于參考資料[1]
隨著在B細胞血液腫瘤領(lǐng)域的巨大成功,，CAR-T療法的臨床前研究和臨床試驗發(fā)展迅速,。目前，就臨床數(shù)目而言,，CAR-T療法在腫瘤免疫領(lǐng)域僅次于基于免疫檢查點抑制劑的療法,。中國和美國則是推動CAR-T療法臨床轉(zhuǎn)化的主力軍[2]。相較于美國,，接近八成的國內(nèi)研究已處于臨床階段,。同時，對比2018年,，我們可以看到國內(nèi)制藥企業(yè)對于CAR-T療法的布局和推動[2],。
CAR-T治療臨床研究數(shù)目,，來源于參考資料[2]
當下,，如何將CAR-T療法的成功復制至非B細胞血液腫瘤和實體瘤是該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵點和重點。在實體瘤研究方向,，體內(nèi)研究和臨床試驗證明Therapeutic window的存在,，并發(fā)現(xiàn)CAR-T細胞能清除靶點陰性的腫瘤細胞，為攻克實體瘤提供一絲曙光[2],。除了腫瘤領(lǐng)域,，CAR-T研究已衍生至心臟損傷[3]，HIV[4]和自身免疫[5]等多個疾病領(lǐng)域,，成為了非常有潛力的新興治療技術(shù),。
在此，結(jié)合一線的研究進展,，我們向大家介紹珀金埃爾默生命科學產(chǎn)品線針對CAR-T研究的應用切入點,，助力下一代CAR-T療法研發(fā)。
體外研究應用：
針對CAR-T研究,，珀金埃爾默主要圍繞體外和體內(nèi)兩個方向提供完善的解決方案,。其中，針對體外研究,，我們關(guān)注體外CAR-T細胞的活化,、活力檢測和分析。與Cytotoxic T細胞活化類似,，CAR-T細胞的活化通常伴隨著細胞因子的分泌,、CAR-T細胞的增殖和后特異性靶向腫瘤細胞的殺傷 [6]。針對這三個過程,，我們均提供對應的基于放射/非放射平臺的金標準解決方案,。在此,，我們關(guān)注CAR-T細胞核心功能指標：細胞殺傷的檢測。
1. 靈活應用細胞殺傷解決方案
與傳統(tǒng)的基于化合物和抗體的直接細胞殺傷不同,，基于CAR-T細胞的腫瘤殺傷是細胞-細胞相互作用的結(jié)果,。因此，在分析殺傷中,，檢測方法必須能夠特異區(qū)別靶細胞（腫瘤細胞）和效應細胞（CAR-T細胞）,。常見的細胞活力檢測法，如MTT,、CCK-8和ATP法等,，則不適于直接用于CAR-T介導的特異細胞殺傷檢測。針對區(qū)分的需求,，我們提供兩大金標準檢測法：基于放射的51Cr釋放法和基于非放射的DELFIA® EuTDA細胞毒法[7],。兩種方法都基于利用探針、特異的標記靶細胞,。經(jīng)效應細胞殺傷后,，靶細胞出現(xiàn)裂解，并釋放探針到上清中用于定量殺傷效果,。
51Cr釋放法檢測原理圖,，圖片來源于參考資料[8]
除了支持特異檢測細胞殺傷外，51Cr釋放法和 DELFIA® EuTDA細胞毒法的另外一大優(yōu)勢就是靈活性,，支持多種細胞系和原代細胞作為靶細胞或效應細胞,。例如，在近期的靶向CD19的CAR-T臨床研究中,，科研人員通過標記腫瘤細胞,，利用51Cr釋放法證明低親和力的CAR-T 具有更強的細胞殺傷能力。而在后續(xù)的CAR-T無效的病人樣本研究中,，基于同樣的檢測方法,，科研人員通過標記CAR-T細胞作為靶細胞，檢測病人針對CAR-T細胞是否具有免疫反應（Anti-CAR反應）[9],。
體外殺傷檢測結(jié)果,。CAT為低親和力CAR-T，F(xiàn)MC83為常用CAR-T
基于病人臨床樣本的Anti-CAR檢測結(jié)果,。圖片來源于參考資料[9]
通過改變靶細胞,，我們提供的方法學還支持CAR-T療法的安全性分析，例如檢測On target, off tumor脫靶效應帶來的細胞毒性[10],。此外,，同種異體反應也逐漸成為CAR-T療法安全性評價的一個重要考慮因素。針對此,，我們提供DELFIA®BrdU 細胞增殖方法,，通過混合淋巴細胞反應衡量CAR-T細胞的同種異體反應[11],。
利用51Cr釋放法檢測脫靶效應的細胞毒性，圖片來源于參考資料[10],；
基于DELFIA®BrdU 細胞增殖方法檢測CAR-T細胞的同種異體反應,，圖片來源于參考資料[11]
2. 深入成像技術(shù)應用
相較于分子檢測，成像技術(shù)能提供二維到三維的靜止或動態(tài)空間信息,。因此基于成像的高通量篩選更具有選擇性,，適合差異化篩選。例如,，在2017年的臨床研究中,，科研人員利用Opera Phenix高內(nèi)涵平臺，結(jié)合腫瘤細胞/正常細胞混合樣本進行差異化篩選,。利用成像技術(shù)的優(yōu)勢,，研究能發(fā)現(xiàn)只作用于腫瘤細胞、不影響正常細胞活力的藥物,，提升了臨床用藥的安全性[12],。除了提升選擇性外,，成像篩選還能支持幾小時到幾天的長程篩選，因此可用于檢測免疫細胞的多輪殺傷能力[13],。
基于Opera Phenix 的高通量差異篩選流程圖,，圖片來源于參考資料[12]
毫無疑問，憑借其生理相關(guān)性和支持高通量篩選的優(yōu)勢,，3D類器官和微組織球研究是當下多個科研和制藥領(lǐng)域的熱門主題和方向,，也是我們成像應用的重要關(guān)注點,。針對多種腫瘤,，基于小分子藥物的研究已證實3D腫瘤組織樣本能有效預測藥物敏感度[14]。在CAR-T和細胞治療研究方向，3D水平研究也逐漸嶄露頭角,。在近期的研究中,，Opera Phenix高內(nèi)涵平臺被用于衡量、對比靶向Mesothelin的CAR-T細胞的殺傷能力 [15] ,。除了3D水平研究外,，活細胞動態(tài)監(jiān)測也會成為我們針對CAR-T研究的主要開拓點,。與干細胞類似，CAR-T細胞和免疫細胞在活化和行使功能過程中是代謝水平高度動態(tài)的，并持續(xù)存在和癌細胞及其他免疫細胞的相互作用 [16],。因此，基于成像的動態(tài)分析非常適合在體外深入解析CAR-T細胞的功能潛能,。
利用Opera Phenix 檢測CAR-T細胞針對3D腫瘤樣本的殺傷能力，圖片來源于參考資料[15]
體內(nèi)研究應用：
針對體內(nèi)研究,，珀金埃爾默主要提供完善的活體成像解決方案,，包括性能的IVIS系列和對應的細胞株和熒光染料。作為主流的活體成像平臺,，IVIS系列被廣泛用于臨床前CAR-T研究和突破實體瘤治療的多種瓶頸[1],。在此，我們主要介紹助力下一代CAR-T研發(fā)的兩大利器：腫瘤成像和免疫細胞成像,。
1. 腫瘤活體成像：協(xié)助建立復雜的腫瘤模型
圍繞CAR-T臨床前研發(fā),，IVIS系列能協(xié)助建立多種常見的實體瘤和血液瘤模型，靈敏追蹤腫瘤的進展和動態(tài)評估CAR-T細胞的抗癌作用,。在此基礎上,，IVIS系列還可以和多種新興的技術(shù)聯(lián)用，協(xié)助建立復雜的腫瘤表型,。例如,，在靶向多發(fā)性骨髓瘤的CAR-T臨床治療中，一個常見的挑戰(zhàn)就是BCMA陰性腫瘤細胞的存在和出現(xiàn)。對此,，研究結(jié)合Crispr技術(shù),，建立融合螢火蟲報告基因的BCMA陰性腫瘤細胞，并將其混合BCMA陽性腫瘤細胞建立腫瘤模型,?；铙w成像數(shù)據(jù)可以看出，BCMA CAR-T細胞無法作用于BCMA陰性腫瘤細胞,，而靶向GPRC5D的CAR-T細胞能有效*BCMA陰性腫瘤細胞[17],。
結(jié)合Crispr技術(shù)的腫瘤模型建立和活體成像檢測，圖片來源于參考資料[17]
同樣基于Crispr技術(shù),，近期的研究利用活體成像平臺開展和驗證靶向CD8 T細胞的活體Crispr篩選,，為靶向膠質(zhì)母細胞瘤的免疫治療提供了新的靶點[18]。通過改變接種的流程和治療策略,，IVIS系列還可以協(xié)助建立腫瘤復發(fā),、晚期腫瘤和病人來源移植腫瘤模型。
基于Crispr技術(shù)的體內(nèi)篩選驗證流程,，圖片來源于參考資料[18]
2. 免疫細胞活體成像：直觀展示體內(nèi)免疫細胞-腫瘤細胞相互作用
除了腫瘤細胞成像,，我們還能通過標記CAR-T細胞或其他免疫細胞進行活體成像[17]。該應用對于CAR-T和其他免疫療法的研究尤為重要,。因為通過活體成像,，我們能直觀的監(jiān)測、分析免疫細胞的體內(nèi)動態(tài)分布和遷移等關(guān)鍵的信息,。鑒于CAR-T細胞體內(nèi)的擴增,、遷移和腫瘤部位的殺傷功能是當下CAR-T臨床應用的主要限制因素[1]。這些信息的獲得對于新一代CAR-T研發(fā)至關(guān)重要,。
在近期的一份研究中,，科研人員展示了CAR-T細胞遷移能力對于殺傷效果的重要性[19]。利用腫瘤細胞,，尤其是在輻射處理后,，會過表達IL-18的特點，研究人員改造CAR-T細胞,，使其過表達IL-18受體 CXCR-1或CXCR-2來提升體內(nèi)的遷移能力,。結(jié)合帶有報告基因的CAR-T細胞和過表達遠紅外蛋白iRFP720的腫瘤細胞，研究就能直觀追蹤和對比免疫細胞的分布變化和腫瘤的進展情況,，做到體內(nèi)水平的細胞細胞相互作用研究。相較于對照細胞,，改造的CAR-T細胞具有更強的遷移能力和殺傷腫瘤能力,。同時，在晚期腫瘤模型上，研究證實未改造CAR-T細胞主要分布于外周,，不能有效靶向腫瘤部位[19],。
CAR-T體內(nèi)模型的CAR-T細胞成像（左，化學發(fā)光）和腫瘤細胞成像（中,，熒光）,；右圖為對應統(tǒng)計數(shù)據(jù)，圖片基于參考資料[19]
進一步結(jié)合免疫熒光技術(shù),，研究證實了由IVIS采集的化學發(fā)光信號能有效反映治療早期的CAR-T細胞浸潤情況,，是腫瘤微環(huán)境免疫細胞活體追蹤的有力手段。同時,，治療早期的化學發(fā)光信號也能有效預測小鼠的生存時間,，為CAR-T療效預測提供了新的切入點。后,，同時結(jié)合腫瘤和CAR-T細胞活體成像,，我們還能做到靶向CAR-T細胞功能水平的持續(xù)監(jiān)測。在腫瘤消退后,，我們再次植入腫瘤細胞,，建立Re-challenge模型，通過活體成像直觀評價CAR-T細胞的長期分布和功能[19],。
利用免疫熒光和活體成像技術(shù)追蹤治療早期CAR-T細胞的侵潤情況,；CD45指示CAR-T細胞，圖片來源于參考資料[19]
參考資料：
1. Robbie G. Majzner and Crystal L. Mackall?.Clinical lessons learned from the first leg of the CAR T cell journey. Nat Med. 2019 Sep;25(9):1341-1355.
2. Jia Xin Yu, et al. The global pipeline of cell therapies for cancer Nat Rev Drug Discov. 2019 Oct;18(11):821-822.
3. Haig Aghajanian, et al. Targeting cardiac fibrosis with engineered T cells. Nature. 2019 Sep;573(7774):430-433.
4. Herzig E, et al. Attacking Latent HIV with convertibleCAR-T Cells, a Highly Adaptable Killing Platform. Cell. 2019 Oct 31;179(4):880-894.e10.
5. Taking CAR-T Cells Beyond Cancer: A New Therapy for Autoimmune Disease https://www.labiotech.eu/interviews/car-t-cells-txcell-treg-cells/
6. Restifo NP , et al. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 2012 Mar 22;12(4):269-81.
7. 細胞治療干貨 | 免疫細胞殺傷經(jīng)典案例https://mp.weixin.qq.com/s/47krDPy-vsxSP91T1GDw
8. van der Haar Àvila I , et al. Evaluating Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity by Chromium Release Assay. Methods Mol Biol. 2019;1913:167-179.
9. Ghorashian S , et al. Enhanced CAR T cell expansion and prolonged persistence in pediatric patients with ALL treated with a low-affinity CD19 CAR. Nat Med. 2019 Sep;25(9):1408-1414
10. Fisher J , et al. Engineering γδT cells limits tonic signaling associated with chimeric antigen receptors. Sci Signal. 2019 Sep 10;12(598).
11. Chan WK, et al. Chimeric antigen receptor-redirected CD45RA-negative T cells have potent antileukemia and pathogen memory response without graft-versus-host activity. Leukemia. 2015 Feb;29(2):387-95.
12. Snijder B, et al. Image-based ex-vivo drug screening for patients with aggressive haematological malignancies: interim results from a single-arm, open-label, pilot study. Lancet Haematol. 2017 Dec;4(12):e595-e606.
13. Hernandez-Hoyos G, et al. MOR209/ES414, a Novel Bispecific Antibody Targeting PSMA for the Treatment of Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer. Mol Cancer Ther. 2016 Sep;15(9):2155-65.
14. Lee JK, et al. Pharmacogenomic landscape of patient-derived tumor cells informs precision oncology therapy,；Nat Genet. 2018 Oct;50(10):1399-1411.
15. Zhang Z, et al.Modified CAR T cells targeting membrane-proximal epitope of mesothelin enhances the antitumor function against large solid tumor. Cell Death Dis. 2019 Jun 17;10(7):476.
16. Sukumar M, et al.Metabolic reprograming of anti-tumor immunity. Curr Opin Immunol. 2017 Jun;46:14-22.
17. Smith EL, et al.GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Sci Transl Med. 2019 Mar 27;11(485).
18. Ye L, et al.In vivo CRISPR screening in CD8 T cells with AAV-Sleeping Beauty hybrid vectors identifies membrane targets for improving immunotherapy for glioblastoma. Nat Biotechnol. 2019 Nov;37(11):1302-1313.
19. Jin L, et al.CXCR1- or CXCR2-modified CAR T cells co-opt IL-8 for maximal antitumor efficacy in solid tumors. Nat Commun. 2019 Sep 5;10(1):4016.
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報告題目：從基因到表型組學的藥物研發(fā)一體化智能平臺
報告人：珀金埃爾默市場開發(fā)主管 徐雍羽博士
報告時間：11月30日9:20-9:45
報告地點：細胞治療與基因治療分會場
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