氣相色譜法快速測(cè)定疏血通注射液中乙酸,、丙酸、丁酸的含量

疏血通注射液是由水蛭和地龍制成的一種主要應(yīng)用于急性腦卒中的中藥注射劑,，水蛭作為傳統(tǒng)中藥，具有破血通經(jīng),，逐瘀消癥的功效,，臨床主治心腦血管疾病，包括急性心肌梗死,、冠心病心絞痛、高血壓,、腦出血,、腦梗死等,。

化學(xué)成分包括多肽、氨基酸,、糖脂、碟啶,、甾體及羧酸酯等化合物,。地龍性寒,、味咸，具有痛經(jīng)活絡(luò),、平肝息風(fēng),、清熱止驚的功效，研究報(bào)道地龍具有抗炎鎮(zhèn)痛,、降脂、抑制血小板聚集等作用,，化學(xué)成分主要包括蛋白質(zhì),、多肽,、氨基酸、有機(jī)酸類,、核苷等化合物,。

短鏈脂肪酸（SCFAs）主要由腸道微生物代謝碳水化合物及蛋白質(zhì)形成,，分為直鏈型[甲酸（FA）,、乙酸（AA）,、丙酸（PA）、丁酸（BA）,、戊酸（VA）、己酸（HA）]與支鏈型[異丁酸（i-BA）,、異戊酸（i-VA）],。

研究發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸與高血壓,、高血脂、高血糖以及動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切,。乙酸、丙酸,、丁酸占人體中短鏈脂肪酸的95%以上,，其具有明顯的活性,，發(fā)揮重要的生理作用。

乙酸可通過短鏈脂肪酸受體FFAR2影響胰島素的分泌,，丙酸具有抗炎,、降脂,、降低血糖的生理作用，丁酸可預(yù)防和抑制結(jié)腸癌,，具有降血糖,，降低膽固醇的作用,。

研究發(fā)現(xiàn)疏血通注射液中含有大量的乙酸、丙酸,、丁酸，因此有必要對(duì)疏血通注射液中的乙酸、丙酸,、丁酸進(jìn)行檢測(cè)分析,，為更好的控制疏血通注射液的質(zhì)量提供依據(jù),。

短鏈脂肪酸的分析方法較多，如氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）,、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）、毛細(xì)管電泳法（CE）等,。

由于短鏈脂肪酸無紫外吸收且極易揮發(fā)，采用液相色譜法,、毛細(xì)管電泳法串聯(lián)紫外檢測(cè)器測(cè)定時(shí),，樣品需進(jìn)行衍生化處理,，操作過程繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng),，與氣質(zhì)聯(lián)用法相比，使用氣相色譜法測(cè)定疏血通注射液中短鏈脂肪酸更加方便快捷,。

采用氣相色譜法直接測(cè)定疏血通注射液中乙酸,、丙酸,、丁酸，無需衍生化,，方法簡(jiǎn)單,、快速,、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng),、靈敏度高、重現(xiàn)性好,，可以準(zhǔn)確有效的分析疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸含量,。

1、儀器與材料

GC-9280型氣相色譜儀,；

DB-FFAP毛細(xì)管柱（30.00m×0.25mm×0.25μm,；）；

十萬分之一電子天平,、

萬分之一電子天平；

超聲波清洗器,；

振動(dòng)攪拌器。

無水乙醇,、濃鹽酸，超純水,，對(duì)照品乙酸、丙酸,、丁酸,、2-乙基丁酸對(duì)照品,。

2、方法

2.1 儀器與試劑

取乙酸,、丙酸、丁酸對(duì)照品適量,，精密稱定，分別置于10mL容量瓶中,，加75%乙醇溶液定容,，得到對(duì)照品儲(chǔ)備液,，濃度分別為乙酸10.63mg/mL,、丙酸3.192mg/mL、丁酸1.739mg/mL,；

取2-乙基丁酸（2-eBA）對(duì)照品適量，精密稱定,，置于100mL容量瓶中,，以75%乙醇進(jìn)行定容,，得濃度為628.7μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中備用,。

分別取各對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，于10mL容量瓶中,，加濃鹽酸100μL，以75%乙醇溶液定容,，得到混合對(duì)照品溶液,，濃度分別為乙酸1063.3μg/mL,、丙酸240.0μg/mL,、丁酸150.0μg/mL、2-乙基丁酸22.0μg/mL,，并采用75%乙醇溶液（含1%鹽酸，2-乙基丁酸22.0μg/mL）1∶1逐級(jí)稀釋成一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液,。

2.2 供試品溶液的配制

疏血通注射液樣品0.5mL置于離心管中，加1.5mL1.5%鹽酸乙醇溶液（含內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸29.5μg/mL）,，混勻，作為供試品溶液,。水蛭,、地龍粉末各0.5g置于10mL容量瓶中,，加1%鹽酸乙醇溶液振搖，混勻，作為水蛭,、地龍供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：DB-FFAP彈性石英毛細(xì)管柱,；

升溫程序：初始溫度50℃保持1min，以15℃/min升至120℃后保持6min,，以7℃/min升至135℃保持1min,，以100℃/min升至230℃后保持3min,，進(jìn)樣口溫度：240℃，

檢測(cè)器（FID）溫度：240℃,，

進(jìn)樣體積：3μL，

分流比：10∶1,，

載氣：高純氮?dú)猓?/span>N2）,，純度＞99.999%,，流速1.0mL/min，尾吹氣：高純氮?dú)猓∟2）,，純度＞99.999%,，流速25mL/min,，氫氣流速30mL/min，空氣流速400mL/min,。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

取“2.1"項(xiàng)下配制的一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“2.3"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,。記錄色譜峰峰面積,，以對(duì)照品濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以各化合物峰面積（AST）與內(nèi)標(biāo)物峰面積（AIS）比值為縱坐標(biāo),，繪制各對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù),，以信噪比S/N=3,、S/N=10分別測(cè)定各化合物的檢測(cè)線和定量限。研究結(jié)果表明：乙酸,、丙酸,、丁酸在其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，結(jié)果見表1,。

按照“2.2"項(xiàng)下方法制備疏血通注射液供試品溶液,，進(jìn)行日內(nèi)精密度,、日間精密度（每日分別制備供試品溶液）、重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),。

日內(nèi)精密度RSD均小于2.4%,，日間精密度RSD均小于0.66%,，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明：疏血通注射液中乙酸含量211.70μg/mL，丙酸含量70.20μg/mL,，丁酸含量25.60μg/mL,，RSD均小于1.3%,；各化合物在室溫條件下8h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD均小于2.3%,，結(jié)果見表1,。

在此基礎(chǔ)上,，開展疏血通注射液中乙酸、丙酸,、丁酸含量測(cè)定的加樣回收率實(shí)驗(yàn),。取疏血通注射液250μL，加入與樣品中乙酸,、丙酸、丁酸量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品溶液500μL（含乙酸106.4μg/mL,、丙酸28.73μg/mL,、丁酸24.35μg/mL），加入75%乙醇（含2%鹽酸,，內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸35.20μg/mL）1.25mL，混勻,，按照“2.3"項(xiàng)下色譜條件分析,，乙酸,、丙酸、丁酸平均加樣回收率為96.45%~103.70%,，RSD均小于4.2%,，結(jié)果見表2。

3.2 疏血通注射液中乙酸,、丙酸,、丁酸的含量分析

采用建立的氣相色譜-氫焰離子化檢測(cè)器方法分析了疏血通注射液中乙酸,、丙酸、丁酸,，氣相色譜圖見圖1,，結(jié)果顯示各酸分離良好，空白溶劑對(duì)其測(cè)定無干擾,，原料藥水蛭、地龍樣品中均含有乙酸,、丙酸,、丁酸,。

對(duì)36批疏血通注射液進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果如表3所示：

疏血通注射液中乙酸含量為382.2~544.6μg/支,，

丙酸含量為90.92~217.5μg/支；

丁酸含量為39.74~64.27μg/支,；

乙酸,、丙酸、丁酸的總含量為545.8~815.8μg/支,。

3種短鏈脂肪酸中乙酸相對(duì)含量最高,，丙酸次之，丁酸,，各酸含量差異較大，3種酸總含量相對(duì)穩(wěn)定,。

2015年版中國(guó)藥典一部附錄水蛭藥材為螞蟥,、水蛭和柳葉螞蟥的干燥全體,，地龍藥材為參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓,、威廉環(huán)毛蚓和櫛盲環(huán)毛蚓除去內(nèi)臟的干燥體,。

疏血通注射液由水蛭與地龍?zhí)崛?、精制而成，將水蛭,、地龍藥材分別置于0.9%氯化鈉溶液中浸漬24h絞碎研磨制成勻漿,，勻漿液反復(fù)凍融,、離心，分取上清液,，超濾柱粗濾,，濾液熱壓處理得水蛭,、地龍?zhí)崛∫海崛∫夯靹虺瑸V,，除菌,，分裝即可。

疏血通注射液在制備過程中未引入含乙酸,、丙酸、丁酸的試劑,，而水蛭與地龍藥材的氣相分析結(jié)果顯示兩種藥材中均含有乙酸,、丙酸、丁酸,，因此推斷疏血通注射液中的乙酸、丙酸,、丁酸源自水蛭和地龍,。

綜上所述，本研究建立的疏血通注射液中乙酸,，丙酸，丁酸的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便,、快速,、靈敏,，為更好的控制該注射液的質(zhì)量提供了依據(jù)，也為中藥注射液的質(zhì)量控制研究提供了參考,。