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利用飛行時間核酸質(zhì)譜定量檢測超微量樣本中核酸表觀修飾的新方法LAMP-MS

閱讀：165 發(fā)布時間：2025-3-28
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2024年11月4日,，國際化學(xué)類頂級期刊《德國應(yīng)用化學(xué)國際版》（Angewandte Chemie-international Edition）（IF 16.1）上發(fā)表了題為《LAMP-MS for Locus-Specific Visual Quantification of DNA 5mC and RNA m6A Using Ultra-Low Input》的研究論文。報(bào)道了一種基于核酸質(zhì)譜平臺的創(chuàng)新甲基化檢測方法,，該工作由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院胡璐璐研究員團(tuán)隊(duì),、華山醫(yī)院消化科劉杰主任團(tuán)隊(duì)、美國芝加哥大學(xué)何川院士團(tuán)隊(duì)攜手柏锘（上海）醫(yī)療科技有限公司共同完成,。

該研究中所使用的飛行時間質(zhì)譜平臺為聚光科技生命科學(xué)板塊旗下聚致生物（GenWish）自主研發(fā)的GeneTOF 3100核酸質(zhì)譜分析系統(tǒng),。

液體活檢技術(shù)通過收集血液中來自各種組織的游離DNA（cfDNA），對其中包含的生物標(biāo)志物（如基因突變,、甲基化或羥甲基等表觀修飾）進(jìn)行檢測,，具有無創(chuàng)、高效的特點(diǎn),。與傳統(tǒng)的各種檢測技術(shù)（例如胃腸鏡,、血清標(biāo)志物）相比，液體活檢在臨床上具有革命性的優(yōu)勢,，在癌癥等疾病的早篩早診,、預(yù)后監(jiān)測、療效評估等諸多方面有廣闊的應(yīng)用前景,。

DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾,，可在腫瘤發(fā)生的早期被檢測到，且具有較好的穩(wěn)定性,，因此成為腫瘤液體活檢中一個生物標(biāo)志物,。但是，目前基于亞硫酸氫鹽測序技術(shù)的甲基化檢測方法,，很難避免DNA的降解,；且高通量測序成本較高，實(shí)驗(yàn)后的分析工作復(fù)雜,；PCR檢測涵蓋的位點(diǎn)也有限,，因此開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、可靠,、通量靈活且能夠覆蓋多位點(diǎn)的新甲基化檢測方法,，是非常具有意義的。

研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的LAMP-MS方法創(chuàng)造性地將線性擴(kuò)增和飛行時間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合在一起,，只需要1ng血漿cfDNA,，通過多重PCR和單堿基引物延伸，能夠在較短時間內(nèi)同時檢測數(shù)十個甲基化位點(diǎn),。該技術(shù)主要操作步驟如圖1所示：

LAMP-MS的完整工作流程

從血漿中提取1ng的cfDNA樣本,，經(jīng)過末端修復(fù)后，用含有甲基化雙鏈T7啟動子的DNA接頭進(jìn)行連接；

進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理后,，非甲基化的胞嘧啶（dC）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（dU）,，而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不變；

使用T7 RNA聚合酶進(jìn)行無偏好性線性擴(kuò)增,，產(chǎn)生μg數(shù)量級的RNA產(chǎn)物,；

逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生微克水平的cDNA；

通過序列特異性PCR對含有特定DNA甲基化位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增,；

對特定的DNA片段進(jìn)行文庫構(gòu)建和淺測序（1~2G深度）,，稱為靶向LAMP-Seq，以確定5mC的化學(xué)計(jì)量,；

利用位點(diǎn)特異性引物進(jìn)行單堿基延伸,，如果延伸位點(diǎn)配對的是ddATP，代表此處為未甲基化的C,，如果是ddGTP則代表甲基化的5mC,，通過相應(yīng)的質(zhì)譜峰計(jì)算 5mC/C 比值。

為驗(yàn)證LAMP-MS方法的性能,，研究團(tuán)隊(duì)合成了含有0%,、5%、10%,、25%,、50%、75%及100% 5mC的一系列DNA探針混合物,，利用1ng的上述探針混合物對LAMP-MS方法進(jìn)行測試,。結(jié)果表明，LAMP-MS能夠準(zhǔn)確地定量測量從0%到100%的5mC（圖2A）,，圖2B中標(biāo)曲表明檢測準(zhǔn)確性和理論值高度吻合,。此外，文章表示,，LAMP-MS在1ng探針混合物體系下的檢測限為5%的5mC的甲基化率（圖2B）,。

圖2A 使用1ng 5mC探針驗(yàn)證LAMP-MS方法的靈敏度和準(zhǔn)確性

圖2B 使用1ng 5mC探針驗(yàn)證LAMP-MS方法的靈敏度和準(zhǔn)確性

在臨床上，來自癌癥患者血漿cfDNA樣本的生物標(biāo)志物豐度因人而異,，因此研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用真實(shí)樣本對LAMP-MS方法進(jìn)行了驗(yàn)證,。從10名結(jié)直腸癌患者和10名非結(jié)直腸癌患者中各獲取1ng的cfDNA樣本，檢測了結(jié)直腸癌篩查中有代表性的標(biāo)志物——SEPTIN9基因的4個甲基化位點(diǎn),，發(fā)現(xiàn)LAMP-MS能夠準(zhǔn)確測定四個 SEPTIN9 位點(diǎn)的 5mC 甲基化率,，且結(jié)直腸癌組和非結(jié)直腸癌組之間存在顯著差異，與高通量測序結(jié)果有很好的一致性（圖3）,。

圖3 在結(jié)直腸癌和非結(jié)直腸癌患者中驗(yàn)證LAMP-MS方法

研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為,，同樣的策略也可以拓展到RNA的定量檢測中,，例如在大多數(shù)高等生物mRNA中含量豐富、并且對于生命過程起著重要調(diào)節(jié)作用的m6A修飾的檢測,。

研究團(tuán)隊(duì)將已發(fā)表的GLORI技術(shù)和核酸質(zhì)譜有機(jī)整合成為m6A Mass Array方法,。該方法從HELA細(xì)胞中提取mRNA，將未甲基化的腺嘌呤轉(zhuǎn)化為肌苷,，甲基化的m6A則保留下來,。經(jīng)過末端修復(fù)、加接頭,，再將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為模板進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增,，然后在m6A位點(diǎn)進(jìn)行單堿基延伸,，若延伸ddATP則對應(yīng)檢測位點(diǎn)為m6A，ddGTP對應(yīng)未甲基化的腺嘌呤,。從而能夠計(jì)算出該位點(diǎn)的 m6A/A 比率,。

對比HELA細(xì)胞mRNA中RXRA基因（100% m6A），TNFRSF10B基因（100% m6A）和FBXL19基因（53% m6A）,，及其各自鄰近的非甲基化腺嘌呤位點(diǎn),，證明該m6A核酸質(zhì)譜方法能夠進(jìn)行有效的RNA甲基化定量檢測（圖4）。

圖4 m6A核酸質(zhì)譜方法：流程及驗(yàn)證

綜上所述,，LAMP-MS（及m6A MASS ARRAY方法）基于核酸質(zhì)譜技術(shù),，可以實(shí)現(xiàn)超低量樣本的甲基化檢測，且結(jié)果可以直接可視化,，不需要高通量測序繁復(fù)的數(shù)據(jù)分析處理過程,；該技術(shù)利用核酸質(zhì)譜前處理體系，在單反應(yīng)中可實(shí)現(xiàn)檢測多個5mC位點(diǎn)的檢測,，且具有良好的特異性,，在臨床上可用于同時篩查多種癌癥類型的標(biāo)志物；并且,，質(zhì)譜檢測也具有靈敏度和精密度的特點(diǎn),，能夠在極低樣本量下提供高度可靠的分析結(jié)果，是低豐度變異標(biāo)志物檢測的理想平臺,；最后,，核酸質(zhì)譜通量靈活，無需湊樣,，能夠從容應(yīng)對大樣本量的臨床驗(yàn)證工作或小樣本量的研究工作,。

因此，LAMP-MS技術(shù)有潛力作為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域重要的實(shí)用工具,，為科研工作者的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床樣本檢測提供了經(jīng)濟(jì)且先進(jìn)的應(yīng)用方案,。

聚致生物核酸質(zhì)譜平臺

GeneTOF系列核酸質(zhì)譜分析系統(tǒng)是準(zhǔn)確,、經(jīng)濟(jì)、高效的多重自動化基因檢測平臺,，能夠在單反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)1~50個基因位點(diǎn)變異靶標(biāo)的精確檢測,，變異類型包括SNP突變、甲基化,、拷貝數(shù)變異,、基因融合、堿基插入/缺失等,。在腫瘤防治,、出生缺陷防控、藥物基因組,、病原體檢測等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用,。

聚致生物

杭州聚致生物科技有限公司（簡稱“聚致生物"）創(chuàng)立于2021年，總部位于浙江杭州,，是國內(nèi)儀器裝備企業(yè)——聚光科技生命科學(xué)旗下子公司,，專注于生物質(zhì)譜類及相關(guān)儀器產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和推廣,，致力于以先進(jìn)分析技術(shù)推動生命科學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,，共建良好的產(chǎn)業(yè)生態(tài)。

聚致生物定位于上游儀器平臺供應(yīng)商,，以開放的態(tài)度同生命科學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)機(jī)構(gòu)合作,，共同培育終端應(yīng)用市場，造福人類的美好生活,。

聚致生物產(chǎn)品

GeneTOF系列核酸質(zhì)譜分析系統(tǒng)

MEC-1000 核酸片段分析儀

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