一,、實驗原理
蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當(dāng)Ph>PI時帶負電荷,，在電場作用下向正極移動,；當(dāng)PH<PI時帶正電荷，在電場作用下向負極移動,；當(dāng)pH＝PI時凈電荷為零,，在電場作用下既不向正極也不向負極移動，此時Ph就是該蛋白質(zhì)的等電點,。
各種PH蛋白質(zhì)的PI不同,，利用各種蛋白質(zhì)PI不同，以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物,，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體,，兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自PI形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的PH梯度,。
在電場作用下,，蛋白質(zhì)在此PH梯度凝膠中泳動,，當(dāng)遷移到PH值等于PI處時，就不再泳動,，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶,，這種分離蛋白質(zhì)的方法稱為聚丙烯酰胺等電聚焦電泳。
聚丙烯酰胺等電聚焦電泳操作簡單,，電泳時間短,，分辨率高。其應(yīng)用范圍廣,，可用于分離蛋白質(zhì)及測定PI,，也可用于臨床鑒別診斷、農(nóng)業(yè),、食品研究及動物分類等各種領(lǐng)域,。隨著其他技術(shù)的不斷改進，等電聚焦電泳也不斷充實完善,，從柱電泳發(fā)展到垂直板,，又繼而發(fā)展到超薄型水平板電泳等，還可與其他技術(shù)或SDS-PAGE結(jié)合,，進一步提高靈敏度與分辨率,。
二、實驗用品
（一）器材
（1）垂直管電泳槽和玻管,。
（2）恒壓恒流電泳儀,。
（3）酸度計
（二）試劑
（1）凝膠貯液：丙烯酰胺30g,甲叉雙丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色試劑瓶中,，4℃貯存,。
（2）10% TEMED:取10mlTEMED,加重蒸水至100ml,置棕色瓶內(nèi)，4℃貯存,。
（3）5%過硫酸胺：稱AP1.0g,加重蒸水至10ml,，當(dāng)天配制。
（4）電極緩沖液,。
5%磷酸溶液：量取58.8ml85%磷酸,，定容至1000ml。
2%NaOH溶液：稱20gNaOH,，溶于蒸餾水并定容至1000ml,。
（5）兩性電解質(zhì)載體PH3~10。
（6）染色液：稱取考馬斯亮藍R-250 50mg,，溶于10ml冰乙酸,，用重蒸水定容至100ml。
（7）脫色液：10%冰醋酸。
（8）40%蔗糖溶液：稱取40g蔗糖溶于少量蒸餾水中,，定容至100ml.
（三）材料
稱取牛血清白蛋白7mg及牛胰核糖核酸酶5mg,，共溶于1ml蒸餾水中，置冰箱備用,。
三,、實驗程序
（一）操作方法
1.凝膠柱的制備
預(yù)先準備潔凈的玻管兩根，玻璃管的一端插在青霉素或疫苗小瓶的橡皮帽中,，使其垂直站立在桌面上或管架中,。
將配好的凝膠溶液用細長頭滴管加到預(yù)先準備好的玻管中，至離上端1cm處,，再用注射器緩緩加水3~5mm高,，靜止聚合30min,待凝膠與水層之間出現(xiàn)折射率不同的界面時，說明凝膠聚合,，再放置0.5h，待聚合*,。
2. 電泳
用手指壓迫橡皮帽使其變形,，讓空氣進入，小心地撥出玻管,。倒出凝膠上層水 ,，用濾紙吸干，并用蒸餾水洗去蔗糖溶液,，把管固定到電泳槽上槽的洞中,，安裝時要保證凝膠管垂直且橡膠塞孔密封不漏?？梢栽诓壑邢燃尤?%磷酸緩沖液,，檢驗是否漏液。再在下槽中裝入2%NaOH溶液,，把上槽放在下槽上,，避免管下有氣泡。上槽接電泳儀的正極,，下槽接負極,，先調(diào)出電壓至100V，待電壓穩(wěn)定后再升到300V,，電泳2h以上至電流降為0,，將電壓調(diào)至0，關(guān)閉電源,。
3,、剝膠
電泳結(jié)束后，取下冷凝管，用蒸餾水充分洗凈兩端電極液,，在凝膠條的正插一銅絲為標記,。用灌滿水的注射器長針頭插入凝膠與玻管管壁之間，邊壓水邊慢慢轉(zhuǎn)運玻管,，推針前進,，同時注入水靠水流壓力和潤滑力將玻璃管內(nèi)壁與凝膠分開，凝膠條即可流出,。
4.固定染色
取其中一條凝膠條放在一塊潔凈的玻板上,，用尺量出固定前的凝膠條長度。放入染色液體中同時進行固定染色1~2h,，用蒸餾水漂洗數(shù)次后用脫色液脫色,，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，量出蛋白帶距正的距離,。
5. pH梯度的制作
取另一條凝膠條放在玻板上,，用尺貼近凝膠條，用干凈的刀片,，從凝膠的正開始,，每隔0.5cm切下一段，依次放入已編好號并裝有1ml蒸餾水的試管中,，浸泡過液,。次日用酸度計分別測定每管浸提液的pH值。以凝膠長度為橫坐標,，pH值為縱坐標,，繪制標準pH梯度曲線。
6. 蛋白質(zhì)樣品等電點的計算
用下式求出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正的實際長度為：
固定后的蛋白區(qū)帶中心距凝膠條正的距離×（固定染色前凝膠條長度/固定染色凝膠條長度 ）
計算出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正的實際長度后,，直接從PH梯度曲線上求出該蛋白質(zhì)的等電點,。
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