一,、實(shí)驗(yàn)原理
聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑在加速劑過硫酸銨或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳,。
聚丙烯酰胺凝膠具有下列特性：
在一定濃度時(shí),，凝膠透明，有彈性,，機(jī)械性能好,；
化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng),，在很多溶劑中不溶,；
對(duì)PH和溫度變化較穩(wěn)定；
幾乎無吸附和電滲作用,，只要Acr純度高,，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好,；
樣品不易擴(kuò)散且用量少,；
凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的相對(duì)分子質(zhì)量選擇合適的濃度,，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑,；
分辨率高。
血清蛋白在紙或醋酸纖維薄膜電泳中,，只能分離出5~6條區(qū)帶,，而聚丙烯酰胺電泳卻可分離出數(shù)十條區(qū)帶，因而,，目前PAGE已廣泛用于科研,、農(nóng)、醫(yī)及臨床診斷的分析,、制備,，如蛋白質(zhì)、酶,、核酸,、血清蛋白、脂蛋白的分離及病毒、細(xì)菌提取液的分離等,。
二,、實(shí)驗(yàn)用品
（一）器材
（1）夾心式垂直板電泳槽和凝膠模,。
（2）直流穩(wěn)壓電源,。
（3）水泵或油泵，真空干燥器,。
（4）移液管,。
（二）試劑
（1）凝膠貯液：丙烯酰胺30g,甲叉雙丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色試劑瓶中,，4℃貯存,，一般可保存1個(gè)月左右。
（2）分離膠緩沖液：取1mol/L 鹽酸42ml,，Tris36.6g,加重蒸水至80ml使其溶解,，調(diào)PH8.9，然后用重蒸水定容至100ml,置棕色瓶4℃貯存,。
（3）濃縮膠緩沖液：取1mol/L 鹽酸48ml,，Tris5.98g加重蒸水至80ml，調(diào)PH6.7,，用重蒸水定容至100ml,，置棕色瓶?jī)?nèi)，4℃貯存,。
（4）10%過硫酸胺：稱AP1.0g,加重蒸水至10ml,，當(dāng)天配制。
（5）10% TEMED:取10mlTEMED,加重蒸水至100ml,置棕色瓶?jī)?nèi),，4℃貯存,。
（6）Tris甘氨酸電極緩沖液：稱取Tris6g,甘氨酸28.8g，加蒸餾水至900ml,，調(diào)PH8.3后,，用重蒸水定容至1000ml，置試劑瓶中,，4℃貯存,，臨用前稀釋10倍。
（7）樣品稀釋液：濃縮膠緩沖液25ml+蔗糖10g+0.05%溴酚藍(lán)5ml,，用重蒸水定容至100ml,，置試劑瓶中，4℃貯存,。
（8）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R-250 50mg,，溶于10ml冰乙酸，用重蒸水定容至100ml。
（9）脫色液：10%冰醋酸,。
（10）保存液：甘油10ml,，冰乙酸7ml,加水至100ml.
（三）材料
新鮮血清（無溶血現(xiàn)象）。
三,、實(shí)驗(yàn)程序
（一）操作方法
1.安裝夾心式垂直板電泳槽
按說明書即可
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2.配膠
本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)體系,，分離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度為3%,，交聯(lián)度均為2.7%,。
3.制備凝膠板
將混合后的分離溶液，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加至長(zhǎng),、短玻璃板間的窄縫內(nèi),，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1ml注射器在凝膠表面沿玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水用于隔絕空氣,，使膠面平整,。
4.加樣
作為分析用的PAGE加樣量?jī)H需幾微克，2-3µl血清電泳后就能分出幾十條蛋白區(qū)帶,。取100µl血清用樣品稀釋液稀釋至1ml,。用微量進(jìn)樣器取25µl上述混合液，通過緩沖液,，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部,，由于樣品溶解液中含有比重較大的蔗糖或甘油，因此樣品溶解液會(huì)自動(dòng)沉降在凝膠表形成樣品層,。待所有凹形樣品槽內(nèi)都加到了樣品,，即可開始電泳 。
5.電泳
將直流穩(wěn)壓電泳儀的正極與下槽連接,，負(fù)極與上槽連接,，接通冷卻水，打開電泳儀開關(guān),，開始時(shí)將電流調(diào)至10mA,。待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)至20~30mA,。當(dāng)溴酚藍(lán)染料遷移至距離硅膠框下緣1cm時(shí),，將電流調(diào)回到零，關(guān)電源及冷卻水,。旋松固定螺絲,，取出硅膠框，用不銹鋼鏟輕輕將玻璃板撬開移去,，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記,，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色,。
6.固定和染色
為防止膠內(nèi)已分離成分的擴(kuò)散，需要進(jìn)行固定,，或浸泡在用7%乙酸液或12.5%Trichloroacetic acid配置的染色液中,，同時(shí)進(jìn)行固定和染色，本實(shí)驗(yàn)固定和染色同時(shí)進(jìn)行,，使染色液沒過膠板,，染色1~2h，經(jīng)常搖動(dòng),，如水浴加熱,，可以縮短染色時(shí)間,。
7.脫色
用10%乙酸浸泡漂洗數(shù)次,，直到背景藍(lán)色褪去。如用50℃水浴,，則可縮短脫色時(shí)間,。
8.制備凝膠干板
1mm以上的膠板常用凝膠真空器制備干板。如無此儀器可將脫色后的膠板浸泡在保存液中3~4h.制干板時(shí)在大培養(yǎng)皿上平放一塊干凈玻璃板,，倒少許保存液在玻璃板上,，使其均勻涂開，取一張預(yù)先用蒸餾水浸透的玻璃紙平鋪在玻璃板上,，趕走氣泡,，將四邊多余的玻璃紙緊緊貼于玻璃板的背面。平放于桌上自然干燥1-2d,，*干后除去玻璃板,，即可得到平整、透明的干膠板,，此干板可長(zhǎng)期保存,，便于定量掃描。
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