原創(chuàng) 飛飛 賽默飛色譜與質(zhì)譜中國
關(guān)注我們,，更多干貨和驚喜好禮
李丕 邢江濤
代謝組學(xué)旨在對給定生物學(xué)背景下的所有代謝物（小分子）進(jìn)行識別和定量,。質(zhì)譜法是對小分子進(jìn)行準(zhǔn)確分析的最強(qiáng)大工具之一，可以檢測成百上千種代謝物,。然而,，由于數(shù)據(jù)庫覆蓋范圍有限及代謝組的復(fù)雜性，通常只有不到30%的化合物被鑒定,，而未注釋的峰很可能是感興趣化合物,。因此未知物識別一直是代謝組學(xué)研究中最耗時(shí)的步驟,，依賴質(zhì)譜專家對數(shù)據(jù)進(jìn)行勞動密集型的手動注釋。
本文將從分辨率和質(zhì)量精度,、同位素過濾,、CI確認(rèn)、靈敏度,、動態(tài)范圍,、解析軟件這6個(gè)維度討論GC-Orbitrap/MS在代謝組學(xué)中小分子識別和定量的表現(xiàn)。
01
未知物注釋—— HRAM
近十年來隨著 GC-Orbitrap/MS 高分辨氣質(zhì)系統(tǒng)的興起,，整個(gè)代謝組進(jìn)入快速注釋的新時(shí)代,。這得益于GC-Orbitrap/MS超高分辨率（高達(dá)240K）和亞ppm質(zhì)量精度的優(yōu)點(diǎn)。采集樣本生成高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù),，然后利用離子質(zhì)量虧損遞推計(jì)算出未知峰所有可能的分子式,。分辨率是分離兩個(gè)m/z相近離子的能力，質(zhì)量精度是實(shí)測值和理論值的偏差,。分辨率和質(zhì)量精度越高,，滿足篩選條件的分子式越少，越容易得到正確注釋,。
（點(diǎn)擊查看大圖）
（點(diǎn)擊查看大圖）
Misra使用 GC-Orbitrap/MS 分析了標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì) NIST SRM 1950 混合血漿參考樣品,，以評估該平臺對常規(guī)發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)在代謝物注釋和定量方面的適用性[1]。該研究分別通過EI,、PCI 和 NCI 模式自信地鑒定了 263,、93 和 65 種代謝物（代謝組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)倡議MSI置信水平 2），其中 270 種代謝物 (64%) 使用內(nèi)部譜庫進(jìn)行了驗(yàn)證,。另外,，與使用相同 NIST SRM 1950 血漿樣品的已發(fā)表的基于LC-MS 的工作相比，兩個(gè)平臺只有 17% 的代謝物重疊,，說明了血漿代謝組學(xué)研究中使用GC-Orbitrap/MS 平臺的互補(bǔ)性和必要性,。
02
未知物注釋——同位素模式過濾
在高m/z區(qū)域，僅靠高質(zhì)量精度不足以排除足夠多的候選物,，因?yàn)楦?/span>m/z區(qū)域存在更多化學(xué)上可能的分子式,。研究表明同位素模式正交過濾可以排除>95%的錯(cuò)誤候選物。
Qiu使用加標(biāo)的同位素比率離群值分析 (IROA) 進(jìn)行未知代謝物注釋[2],，并證明使用該工作流程生成化學(xué)式的可靠性更高,。本質(zhì)上，IROA 工作流程使用兩種不同的 13C 富集碳源（隨機(jī) 95% 12C 和 95% 13C）以產(chǎn)生鏡像同位素峰對,，二者的質(zhì)量差異揭示了碳鏈長度 (n),，從而有助于鑒定內(nèi)源性代謝物。通過GC-Orbitrap/MS數(shù)據(jù)可以識別 244 個(gè) IROA 峰對,，平均質(zhì)量偏差為1.48 ppm,，這顯著提高了 IROA 的檢測能力（Qiu 之前的工作使用其他類型的高分辨質(zhì)譜,，僅得到 126 個(gè) IROA 峰對，平均質(zhì)量偏差為 32.2 ppm）,。
（點(diǎn)擊查看大圖）
03
未知物注釋——EI+CI互補(bǔ)
元素組成的計(jì)算需要豐富的分子離子,。EI譜圖通常分子離子豐度低或缺失，因此需要使用 CI軟電離獲得分子離子信息,。很多研究都使用GC-Orbitrap/MS 結(jié)合CI電離為顯著失調(diào)的未知物生成可能的分子式,，此處不贅述。
Misra在其研究論文中對GC-Orbitrap/MS輕松切換EI/CI源的功能給予了中肯評價(jià),。他提到,，對于我們的高分辨 GC-Orbitrap/MS 儀器，EI 和 CI 之間的切換很容易,，一個(gè)制備好的樣品可以依次運(yùn)行 EI-MS,、PCI-MS/MS 和 NCI-MS分析。
賽默飛具有獨(dú)特的VPI技術(shù),，可以在不破壞質(zhì)譜真空的情況下2分鐘之內(nèi)切換EI源和CI源,，5分鐘內(nèi)更換色譜柱，消除宕機(jī)時(shí)間,，輕松實(shí)現(xiàn)EI/PCI聯(lián)合定性或雙柱RI定性,。更有EI/CI混合離子源，一個(gè)離子源實(shí)現(xiàn)三種電離模式,。
（點(diǎn)擊查看大圖）
04
高靈敏度——小樣本量發(fā)現(xiàn)更多標(biāo)志物
研究表明,，GC-Orbitrap/MS在代謝組學(xué)中的靈敏度和發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于四極桿質(zhì)譜[3]。若要在兩種儀器得到的響應(yīng)強(qiáng)度相近的TIC,，需要在 四極桿質(zhì)譜上注入濃度高 8 倍的樣品,。以相同參數(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行峰拾取、分組,、過濾后,，分別剩下 114 個(gè)（四極桿）和 339 個(gè)化合物（GC-Orbitrap/MS）——這是 3 倍的差異。這表明GC-Orbitrap/MS的靈敏度更高,，使用更小的樣本量即可增加代謝覆蓋率,。
可用樣本量對于環(huán)境樣本或可擴(kuò)展培養(yǎng)的生物體不是問題，但可能是人類或動物研究的限制因素,。更重要的是，在樣品濃度降低 8 倍的情況下,，GC-Orbitrap/MS 仍檢測生成了幾乎 3 倍的代謝物,。
比較兩種儀器中顯著失調(diào)的化合物,，有趣的是,，兩個(gè)數(shù)據(jù)集的重要化合物只有 28% 重疊。在四極桿數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)缺失46個(gè)失調(diào)化合物,，而 GC-Orbitrap/MS 數(shù)據(jù)集僅缺失9個(gè)失調(diào)化合物。四極桿缺失的化合物中,， 4個(gè)由于解卷積錯(cuò)誤而缺失,；12個(gè)由于p 值或倍數(shù)變化不符合重要化合物的閾值標(biāo)準(zhǔn)而缺失；29個(gè)因檢測到的碎片太少缺失,。由此可見，GC-Orbitrap/MS 可以檢測到更多的化合物,，因?yàn)樗臋z測限較低。此外,，GC-Orbitrap/MS缺失的9種化合物中有2個(gè)被排除是因?yàn)樗鼈兇嬖谟谂囵B(yǎng)基空白中；2個(gè)解卷積錯(cuò)誤缺失,，5個(gè)因 p 值或倍數(shù)變化不符合重要化合物的閾值標(biāo)準(zhǔn),。
（點(diǎn)擊查看大圖）
05
動態(tài)范圍
代謝組學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是生物樣品中代謝物濃度的動態(tài)范圍較大,，跨越4-6 個(gè)數(shù)量級,。對于傳統(tǒng)光電倍增器式質(zhì)譜檢測器，很容易導(dǎo)致飽和,。
GC-Orbitrap/MS是一種新型高分辨質(zhì)譜儀,，動態(tài)范圍高達(dá)6個(gè)數(shù)量級。因此GC-Orbitrap/MS允許引入更多的樣品,，從而獲得更多的低豐度代謝物,。在Qiu的研究中，GC-Orbitrap/MS 具有更寬的動態(tài)范圍,，因此可以檢測到更多的 IROA 峰對,，結(jié)合GC-Orbitrap/MS的高分辨率，共同提高了分子式的可靠性,。
（點(diǎn)擊查看大圖）
呼吸氣檢測可以揭示人體的揮發(fā)性代謝組,，是疾病早期診斷和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的有效工具。Boyle采用熱脫附（TD）與 GC-Orbitrap/MS 聯(lián)用搭建Breath Biopsy呼吸活檢平臺（Owlstone Medical）,，將呼吸樣本收集,、熱解吸和測量聯(lián)系起來，以提供呼吸樣本的綜合概況。GC-Orbitrap/MS 高分辨率質(zhì)譜儀與呼吸活檢結(jié)合使用的主要優(yōu)勢在于動態(tài)范圍寬,、質(zhì)量分辨率高和質(zhì)量準(zhǔn)確度高,，可實(shí)現(xiàn)低濃度和高濃度下的檢測和定量以及快速可靠的化合物鑒定。同一呼吸樣本中可能含有非常高和超痕量（飛克）水平的化合物,，因此獲取廣泛豐度范圍內(nèi)的高質(zhì)量數(shù)據(jù)至關(guān)重要,。超過6個(gè)數(shù)量級動態(tài)范圍使 GC-Orbitrap/MS 輕松勝任呼吸活檢（見下圖）。
（點(diǎn)擊查看大圖）
另外,，呼吸分析通常受到樣本數(shù)量的限制,，因此必須從單一分析中收集定量和定性信息。GC-Orbitrap/MS能夠進(jìn)行平行的靶向和非靶向分析,，從而研究已知和潛在的新型生物標(biāo)志物,。
06
軟件
軟件與儀器本身同樣重要，是成功鑒定化合物的基石之一,。質(zhì)譜硬件當(dāng)下處于非常先進(jìn)的階段,，結(jié)構(gòu)解析的最終成功在于如何深度利用數(shù)據(jù)。這就要求開發(fā)更好的軟件程序,，以及評估HRAM MS數(shù)據(jù)的復(fù)雜工具,。
GC-Orbitrap/MS配套賽默飛專業(yè)的數(shù)據(jù)解卷積、大隊(duì)列的組學(xué)分析,、和化合物質(zhì)譜裂解軟件,。
組學(xué)分析軟件Compound Discoverer內(nèi)置高效靶向和非靶向分析工作流，幫助用戶最大化從代謝組學(xué)樣本中獲得的代謝覆蓋率和未知物質(zhì)注釋方面的信息,，并可進(jìn)行分子網(wǎng)絡(luò),、代謝通路分析。
質(zhì)譜裂解軟件Mass Frontier包含3萬多個(gè)裂解方案,，其中包含十余萬個(gè)反應(yīng)和相關(guān)結(jié)構(gòu),。可以執(zhí)行直接分子搜索,、子結(jié)構(gòu)搜索,、相似性搜索和名稱搜索，并且所有關(guān)聯(lián)的元數(shù)據(jù)都可以電子方式搜索,，可用于開發(fā)計(jì)算機(jī)碎片預(yù)測,。
Mass Frontier質(zhì)譜裂解軟件一瞥（從手繪到電子檢索預(yù)測）（點(diǎn)擊查看大圖）
總結(jié)
在代謝組學(xué)領(lǐng)域,，GC-Orbitrap/MS被積極用于捕獲各種生物學(xué)背景的揮發(fā)性、非極性和極性（衍生）小分子,。短短幾年,，大量研究工作使用 GC-Orbitrap/MS生成了令人興奮的高通量和高質(zhì)量的數(shù)據(jù),，涵蓋基礎(chǔ)研究到應(yīng)用研究領(lǐng)域。通過靶向和非靶向工作流程,，GC-Orbitrap/MS有望提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集,，以應(yīng)對各種研究挑戰(zhàn)。
如需合作轉(zhuǎn)載本文,，請文末留言。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
17
立即詢價(jià)
您提交后,，專屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)