前言： 多肽藥物是介于大分子蛋白/抗體類藥物和小分子藥物之間的一 類重要的藥物分子,，因其生物活性高、靶向?qū)Ｒ恍愿?、選擇性 高,、毒副作用低等優(yōu)點而被廣泛應用于疾病治療領(lǐng)域[1]。Thermo Obitrap因其超高的分辨率,，質(zhì)量軸穩(wěn)定性,，已經(jīng)廣泛應用 在了多肽藥物結(jié)構(gòu)表征中。Obitrap 作為高分辯還具有*靈敏 度和線性范圍,，因此也被越來越多的應用到藥物的定量研究中 [2,3],。
PTH 是甲狀旁腺主細胞分泌的由84個氨基酸組成的多肽類 激素，其對于維持鈣磷代謝的穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用,。 特立帕肽（SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF,，4117.7 Da）是一種人工重組合成的人PTH 1-34多 肽，是第yi個被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,，F(xiàn)DA）批準的抗骨質(zhì)疏松性骨折的骨合成藥物 [3],。 Thermo Scientific Q Exactive Focus 四極桿 Orbitrap 組合型質(zhì) 譜儀專為常規(guī)分析應用而設計，高分辨率為7萬,，大分辨 率12Hz,，可以在同一系統(tǒng)中同時實現(xiàn)準確可靠的定性和定量分 析。 Obitrap Fusion Lumos是賽默飛世爾科技在2015年推出的三合 一的靜電場軌道阱超高分辨質(zhì)譜儀,。Lumos搭載的分段式四級 桿技術(shù)（Advanced Quadrupole Technology,，AQT）使離子傳 輸效率至少提高了 2 倍，超高場的Obitrap擁有50萬分辨率和 20Hz的超快掃描速度,，使Lumos在具有的靈敏度同時,，還 擁有穩(wěn)定性和動態(tài)范圍。 本實驗將基于兩款Obitrap高分辯質(zhì)譜Q Exactive Focus和Obitrap Fusion Lumos建立多肽藥物特立帕肽的定量分析方法，考 察高分辯質(zhì)譜Obitrap的定量能力,。
實驗條件 樣品配置： 稱取特立帕肽粉末,，加水稀釋成5mg/mL的標準品儲備液。用 含5%乙腈,，0.1μg/μL BSA,，1%甲酸的稀釋劑，逐級稀釋特立 帕肽標準品,，配置成標準曲線,。 色譜條件： 液相系統(tǒng)為：Thermo Vanquish Flex液相色譜儀，色譜柱為Thermo AccucoreTM 150 C18（50×2.1mm,，2.6um，貨號16126-052130） ,；柱溫：45℃,；流動相及梯度系統(tǒng)程序見表1
血漿樣品前處理： 取150μL的人空白血漿，加入15μL的特立帕肽工作液,，震蕩混 勻,。按體積比1:6加入含75%乙腈，0.1% FA的沉淀劑后,，充 分震蕩,。6500g離心5min，取上清后,，40℃揮干,。揮干樣品 用150μL含10% ACN，90%水,，1% FA的復溶劑復溶,，充分震 蕩，14000g離心5min,，取上清,，上樣5μL進行分析。 數(shù)據(jù)分析： 所有數(shù)據(jù)分析均使用Thermo Scientific™ TraceFinder™ 軟件完 成,。TraceFinder平臺包含了儀器控制,，方法開發(fā),，數(shù)據(jù)定性定 量批處理等功能,。提峰時質(zhì)量偏差為±5ppm,。 實驗結(jié)果 1,、特立帕肽標準品在Focus,，Lumos上的線性與準確度,。 用稀釋劑（含0.1ug/μL BSA，1% FA,，5% ACN）的稀釋劑逐級 稀釋特立帕肽標準品,，配置成一系列濃度標準品,，上樣分析,。 結(jié)果表明,，F(xiàn)ocus對特立帕肽的定量下限為50 pg/mL（圖1）,， 上樣5μL,，上柱約60 amol,，標準曲線線性良好,，R2=0.997,，標 準曲線各點回算的濃度在理論值的15%以內(nèi)（表4）,。
特立帕肽的LOQ點在Focus和Lumos上的提峰圖如圖3,，峰型良 好,，信噪比S/N>10,，重復5針的RSD<10%（表6），表現(xiàn)出了 良好的穩(wěn)定性。
2,、特立帕肽血漿樣品在Lumos上的線性與準確度,。 同時在Lumos上考察了特例帕肽血漿樣品的定量下限。取150 μL的空白人血漿,，加入一系列濃度梯度的特立帕肽標準品,，配 置成血漿標曲，用1:6體積的75% 乙腈沉淀后,，離心去上清,， 揮干，復溶后進樣,。 結(jié)果顯示,，Lumos對于基質(zhì)復雜的血漿樣品仍表現(xiàn)出良好的線 性,，精密度,，穩(wěn)定性,。特立帕肽低定量下限為50 pg/mL,，線 性范圍50 pg/mL-50 ng/mL（圖4），1000倍的線性范圍,，上柱 量約60 amol,，標曲各點Diff值 < 10%（表7）。
結(jié)論： 本文分別在Obitrap Focus賽默飛四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀,，Lumos上建立了大分子多肽類藥物 特例帕肽的定量分析方法,。結(jié)果表明,，高分辯Obitrap對特立 帕肽表現(xiàn)出良好的定量能力，定量下限可以分別達到上柱60 amol,，24 amol,。同時,，對于基質(zhì)更為復雜的血漿樣品,，Lumos 上可以達到定量下限上柱60 amol,，靈敏度滿足臨床上對特立帕 肽的檢測要求,。Obitrap作為高分辨質(zhì)譜,，在擁有超高分辨率的 同時,，兼具出色的靈敏度和穩(wěn)定性,，可以應用大分子多肽類藥 物的定量分析與檢測。
參考文獻 [1] Lau J L, Dunn M K. Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends, and future directions[J]. Bioorganic & medicinal chemistry, 2018, 26(10): 2700-2707. [2] Dillen L, Cuyckens F. High-resolution MS: first choice for peptide quantification?[J]. Bioanalysis, 2013, 5(10): 1145-1148. [3] Kang L, Weng N, Jian W. LC–MS bioanalysis of intact proteins and peptides[J]. Biomedical Chromatography, 2019: e4633. [4] Quattrocchi E, Kourlas H. Teriparatide: a review[J]. Clinical therapeutics, 2004, 26(6): 841-854.
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