ASMS2020賽默飛線上預(yù)熱講座集錦第四期：生物大分子表征新技術(shù)
飛飛 賽默飛Orbitrap組學(xué)俱樂(lè)部 今天
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疫情并不能停止分析科學(xué)家們技術(shù)交流與分享，6月1-12日,，質(zhì)譜界盛會(huì)—第68屆美國(guó)質(zhì)譜年會(huì),，在線上盛大舉行。在此之前,，賽默飛舉辦了線上預(yù)熱講座,，內(nèi)容涵蓋LC-MS新產(chǎn)品，以及蛋白組學(xué),、生物制藥,、代謝組學(xué)等應(yīng)用方向，所有內(nèi)容現(xiàn)在仍可通過(guò)注冊(cè)進(jìn)行線上觀看,。
前三期,，與大家分享了新儀器的應(yīng)用，蛋白組學(xué)的新技術(shù)與熱點(diǎn),，這期與大家分享講座中的生物大分子表征新技術(shù),。
多樣化液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于完整分子量表征
近年來(lái),，隨著非變性質(zhì)譜技術(shù)的日趨成熟，生物大分子完整分子量表征方法的多樣性也隨之增加,，如色譜及電泳技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用等方法,。
非變性質(zhì)譜進(jìn)行完整分子量分析的主要優(yōu)勢(shì)包括：
1色譜高通用性；
2分析速度快且樣品使用量??；
3質(zhì)譜的高分辨性能及出色的峰容量可獲得高質(zhì)量質(zhì)譜圖。
非變性質(zhì)譜已被工業(yè)界快速接受,，作為完整水平的質(zhì)量屬性監(jiān)測(cè)強(qiáng)有力的分析方法,。此外，非變性質(zhì)譜也能夠在表征實(shí)驗(yàn)室與QC實(shí)驗(yàn)室之間建立強(qiáng)大的關(guān)聯(lián),。本講座介紹了完整分子量分析的技術(shù)重點(diǎn)及方法的穩(wěn)健性,，包括不同質(zhì)譜平臺(tái)間方法轉(zhuǎn)換對(duì)數(shù)據(jù)的影響（從Q Exactive plus到Exploris 480）。
賽默飛完整分子量分析平臺(tái)包括Vanquish Duo雙三元超高效液相,、Exploris 480超高分辨質(zhì)譜,、變色龍數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，及Protein Metrics數(shù)據(jù)分析軟件,。
圖.賽默飛完整分子量分析平臺(tái)（點(diǎn)擊查看大圖）
01
SEC平臺(tái)
在線SEC-MS作為簡(jiǎn)單且穩(wěn)健的分析平臺(tái),，可實(shí)現(xiàn)高通量生物大分子聚集體分析。Vanquish Duo液相平臺(tái)可以使用兩根色譜柱同時(shí)進(jìn)行分析和再平衡,，當(dāng)一根色譜柱在分析時(shí),，另一根色譜柱在平衡，可以大程度節(jié)約分析時(shí)間,，提高分析通量,。
圖.Vanquish Duo實(shí)現(xiàn)高通量分析（點(diǎn)擊查看大圖）
經(jīng)過(guò)液相分離得到的每個(gè)色譜峰經(jīng)過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)，能夠獲得對(duì)應(yīng)的單體及聚體的分子量及糖型信息,。同時(shí),，orbitrap的超高分辨性能可實(shí)現(xiàn)每個(gè)糖型的基線分離，在非變性條件下得到更準(zhǔn)確的分子量信息,。方法穩(wěn)健性的測(cè)試,，連續(xù)進(jìn)樣413次，每24次進(jìn)一針參比品,，17針參比品的色譜疊加圖顯示保留時(shí)間及色譜峰的RSD值在3%以內(nèi),。不同實(shí)驗(yàn)室使用不同批次SEC色譜柱，多次技術(shù)重復(fù)實(shí)現(xiàn)結(jié)果顯示,，單體及聚體的糖型含量保持一致,，具有良好的重現(xiàn)性。
圖.非變性質(zhì)譜平臺(tái)的穩(wěn)健性（點(diǎn)擊查看大圖）
02
質(zhì)譜平臺(tái)轉(zhuǎn)移
將非變性質(zhì)譜平臺(tái)從QE Plus轉(zhuǎn)移至Exploris 480上,，并做了方法驗(yàn)證和對(duì)比,。Exploris 480,，45K分辨率時(shí)，可在保證高信噪比的同時(shí)實(shí)現(xiàn)好的分辨率,，能夠分辨相差25Da的兩個(gè)糖基化修飾峰,，可作為Exploris 480分析完整蛋白時(shí)合適的分辨率。上樣量從1ug到10ug遞增,，譜圖均有良好的信噪比,，且糖型相對(duì)含量一致。
圖.Exploris 480分辨率和上樣量參數(shù)優(yōu)化（點(diǎn)擊查看大圖）
QE Plus及Exploris 480的質(zhì)譜數(shù)據(jù)（多樣本且技術(shù)重復(fù)）對(duì)比顯示,，在完整水平上鑒定的糖型及含量高度一致,，證實(shí)了方法轉(zhuǎn)移的可行性（如下圖所示）。
圖.QE Plus及Exploris 480數(shù)據(jù)對(duì)比（點(diǎn)擊查看大圖）
03
CIEX平臺(tái)
通過(guò)使用可揮發(fā)性鹽流動(dòng)相及PH梯度分離,，可實(shí)現(xiàn)在線CIEX-MS分析,，如下圖a所示，對(duì)于多種單抗混合樣品,，可獲得良好的色譜分離及高質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)（可分辨相差幾十Da的糖化修飾峰）。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,，通過(guò)CIEX-MS分析,，能夠觀測(cè)到堿性峰中的琥珀酰亞胺中間體產(chǎn)物的增加（圖b）；加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,，能夠觀測(cè)到抗體片段的變化（圖c）,。
圖a.CIEX-MS分析多種單抗混合物（點(diǎn)擊查看大圖）
圖b.CIEX-MS分析抗體穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中的堿性峰變化（點(diǎn)擊查看大圖）
圖c.CIEX-MS分析抗體加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中的片段峰變化（點(diǎn)擊查看大圖）
總結(jié)
生物大分子完整分子量分析在工業(yè)界已是一種廣泛認(rèn)可的分析方法，多樣性的前端液相串聯(lián)質(zhì)譜（如反相,，離子交換,，體積排阻色譜等）平臺(tái)已被開(kāi)用應(yīng)用。基于orbitrap的質(zhì)譜平臺(tái)能夠獲得更高分辨及穩(wěn)健性的數(shù)據(jù),，且能夠在不同orbitrap質(zhì)譜型號(hào)間進(jìn)行方法轉(zhuǎn)換,。對(duì)于完整蛋白糖型表征，抗體片段分析,，琥珀酰胺化修飾,、氧化修飾等雜質(zhì)能夠進(jìn)行高通量且準(zhǔn)確分析。
PRCR技術(shù)與MS3在抗體Middle-down蛋白分析中的應(yīng)用
ASMS 2019,，賽默飛重磅推出三合一系列的創(chuàng)新dian峰之作——Thermo Scientific™ Orbitrap Eclipse™質(zhì)譜儀,，*的PTCR技術(shù)可通過(guò)氣相的離子-離子相互作用，將蛋白質(zhì)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移給特定的化合物（C??F??）,，從而造成蛋白質(zhì)本身電荷減少,，得到一系列的電荷減少離子。
采用Middle-down質(zhì)譜分析減少了樣品前處理操作,，降低了人為引入翻譯后修飾的風(fēng)險(xiǎn),，可以更好的獲取抗體的序列信息,。結(jié)合使用PTCR技術(shù)后，通過(guò)降低母離子和/或子離子的價(jià)態(tài),，幫助解析復(fù)雜的MS及MS?譜圖,，可檢測(cè)到更多的母離子及碎片，對(duì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及生物制藥的應(yīng)用大有助益,。
講座中簡(jiǎn)要介紹PTCR技術(shù)結(jié)合MS3與SPS同步母離子掃描技術(shù)在Middle-down蛋白分析中的應(yīng)用,。PTCRMS3分析策略如下，方法設(shè)置中shou選會(huì)用四極桿選擇某一價(jià)態(tài)的母離子,，隨后根據(jù)方法設(shè)置按照不同的碎裂模式,，如ETD，HCD,，UVPD進(jìn)行二級(jí)碎裂,，產(chǎn)生的碎片離子與PTCR離子發(fā)生三級(jí)反應(yīng)，獲得的碎片離子進(jìn)入Orbitrap進(jìn)行質(zhì)量分析,。
以NIST mAb為例,，進(jìn)行middle-down分析前，先使用Ides酶對(duì)單抗進(jìn)行酶切,，然后將單抗還原成LC,，F(xiàn)d，F(xiàn)c三條分子量約為25kDa的亞基,。以分子量大的Fd的序列覆蓋結(jié)果為例,，單獨(dú)使用ETD的Fd序列覆蓋度為52%。ETD碎裂模式結(jié)合PTCR-MS3可以將序列覆蓋度提高至63%,，同時(shí)使用PTCR后對(duì)于分子量大于5kDa的碎片識(shí)別率有了顯著的提高,。
PTCR與HCD碎裂模式聯(lián)合使用時(shí)，同樣也會(huì)提高鑒定效率,。以Fd為例,，PTCR-MS3雖然只是略微增加了Fd的序列覆蓋度，但是互補(bǔ)離子對(duì)的數(shù)量有了顯著增加,，從0對(duì)增加到了7對(duì),。結(jié)合兩者的數(shù)據(jù)可以將序列覆蓋度增加到41.6%，同時(shí)互補(bǔ)離子對(duì)增加到8對(duì),。
PTCR與UVPD聯(lián)合使用時(shí),，可以將LC的序列覆蓋度從64.6%提高至74%。將單用UVPD和PTCR聯(lián)用的結(jié)果整合,，則可以將LC的序列覆蓋度提高至84.4%,，互補(bǔ)離子對(duì)的數(shù)量也有了顯著增加。
常規(guī)的PTCR-MS3分析會(huì)將二級(jí)碎片按照質(zhì)荷比進(jìn)行分段,，成為兩個(gè)質(zhì)譜分析方法,，分多針進(jìn)樣分析,。為了減少進(jìn)樣數(shù)量，在一針?lè)椒ɡ飳?shí)現(xiàn)多段質(zhì)量軸的二級(jí)碎片的PTCR反應(yīng),，可結(jié)合SPS同步母離子掃描技術(shù),。以UVPD碎裂為例，將SPS窗口設(shè)置為目標(biāo)質(zhì)量范圍,，實(shí)現(xiàn)一針進(jìn)樣,，多段分子量的PTCR分析。
SPS結(jié)果顯示,，優(yōu)化了PTCR和UVPD反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)后,，可以實(shí)現(xiàn)LC 54%的序列覆蓋，雖然不及多針進(jìn)樣模式下的結(jié)果,，但仍然可以看出SPS技術(shù)應(yīng)用在PTCR分析中,，減少進(jìn)樣數(shù)量、縮短進(jìn)樣時(shí)間的可能性,。
總結(jié)
Eclipse上*的PTCR（質(zhì)子轉(zhuǎn)移電荷減少）技術(shù)可以將蛋白上的質(zhì)子轉(zhuǎn)移給特定離子,，簡(jiǎn)化蛋白分析中原本十分復(fù)雜的質(zhì)譜圖。聯(lián)合PTCR與其他碎裂模式（ETD,，HCD,，UVPD），使二級(jí)碎片與PTCR離子發(fā)生三級(jí)反應(yīng),，降低碎片譜圖的復(fù)雜程度，可增加抗體蛋白middle-down分析的序列覆蓋度,。
學(xué)習(xí)使人快樂(lè),，通過(guò)四期的分享，希望大家都能從中獲得快樂(lè),。
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