賽默飛色譜及質(zhì)譜

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不停歇的蛋白質(zhì)組學(xué)分析：全新一代Exploris 240質(zhì)譜

閱讀：811 發(fā)布時(shí)間：2020-6-9

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引言

賽默飛是蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的ling導(dǎo)者,，每一款產(chǎn)品一經(jīng)推出即成為萬眾矚目的焦點(diǎn),。今年的質(zhì)譜年會(huì)上賽默飛重磅推出智能化Exploris系列質(zhì)譜—— Orbitrap Exploris 240,。這款新產(chǎn)品的到來，進(jìn)一步拓展了賽默飛超高分辨質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的產(chǎn)品線,，同時(shí)也為我們帶來全新的蛋白質(zhì)組學(xué)體驗(yàn),。讓我們一起領(lǐng)略O(shè)rbitrap Exploris 240質(zhì)譜的豐富多彩的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用吧。

一． Exploris 240的性能參數(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用概覽

1 Exploris 240的性能特點(diǎn)

Exploris 240是四極桿和超高場Orbitrap的串聯(lián)質(zhì)譜,，分辨率可達(dá)240,000,，掃描速度高達(dá)22Hz，在蛋白質(zhì)分析的功能上支持APD（Advanced Peak detection）算法,；R 45000用于TMT 11plex和TMTpro（16plex）的分析,；兼容FAIMS Pro離子淌度接口；支持DDA, DIA, PRM, t-SIM多種掃描模式,；通過Biopharma option的擴(kuò)展m/z 至8000用于完整蛋白分析,；Easy IC的實(shí)時(shí)內(nèi)標(biāo)校正模式使質(zhì)量軸穩(wěn)定在1ppm。

圖1. Orbitrap Exploris 240 MS

產(chǎn)品特點(diǎn)

• 超高場 Orbitrap 分析器

• 質(zhì)量范圍 m/z 40-6000

• 質(zhì)量精度內(nèi)標(biāo) <1ppm,，外標(biāo) <3ppm,，Easy IC 實(shí)時(shí)內(nèi)標(biāo)校正

• 分辨率 > 240,000

• 掃描速度高達(dá) 22 Hz

• 掃描模式：FS, t-SIM, DDA TopN, DDA TopTime, DIA, t-MS2 (PRM), AIF

• 高級掃描模式：AcquireX, APD, TMT @ 45k

• 選配：FAIMS Pro，Biopharma option

2 Exploris 240應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的設(shè)計(jì)理念

Exploris 240質(zhì)譜平臺(tái)上融合了賽默飛在蛋白質(zhì)組學(xué)積累的技術(shù)和工作流程,，通過打包的方式呈現(xiàn)給用戶,。Exploris 240可以開展基于DDA的蛋白質(zhì)鑒定和定量流程，基于DIA的定量流程,，TMT的定量流程,，基于PRM的靶向蛋白定量流程，這些工作流程都以方法模板的形式內(nèi)嵌在質(zhì)譜方法中,，操作人員只需要針對特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇對應(yīng)的方法即可,。同時(shí)Exploris 240延續(xù)了Exploris 480穩(wěn)定的硬件設(shè)計(jì)，可以無間斷分析臨床大隊(duì)列樣本,。

圖2. Orbitrap Exploris 240 質(zhì)譜儀-先的性能,，多功能性和易用性

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二． Exploris 240蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程

1 深度、快速蛋白質(zhì)組覆蓋

賽默飛組學(xué)應(yīng)用開發(fā)團(tuán)隊(duì)對不加FAIMS Pro的4臺(tái)Exploris 240進(jìn)行蛋白鑒定數(shù)目測試（1µg Hela酶切肽段,，60分鐘梯度）,，4臺(tái)Exploris 240蛋白鑒定數(shù)目均在5300個(gè)蛋白以上（圖3），顯示出儀器間具有很好的重現(xiàn)性,。

圖3. Exploris 240在1 µg Hela酶切肽段, 60 min LC gradient, Top 20 method, ES803色譜柱,，不加FAIMS Pro的情況下肽段和蛋白鑒定數(shù)目

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Exploris 240加載了FAIMS Pro 后，蛋白質(zhì)組的覆蓋深度進(jìn)一步提高,，蛋白鑒定數(shù)目可提高25%,。1小時(shí)梯度，1µg Hela酶切肽段中蛋白鑒定數(shù)超過了6000個(gè)蛋白。

圖4. Exploris 240在1 µg Hela酶切肽段, 60 min LC gradient, Top 20 method, ES803色譜柱,不加裝FAIMS Pro,，F(xiàn)AIMS單電壓CV (-45V), FAIMS雙電壓 (-50/70V)的條件下肽段和蛋白鑒定數(shù)目

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接著對不同梯度的200ng Hela進(jìn)行蛋白鑒定深度測試,，30分鐘可鑒定3432個(gè)蛋白，60分鐘可鑒定5064個(gè)蛋白,，90分鐘可鑒定5986個(gè)蛋白,，120分鐘可鑒定6335個(gè)蛋白。

圖5.Exploris 240在200ng Hela酶切肽段, 不同色譜梯度, Top 20 method,，Ionopticks 625px column,，F(xiàn)AIMS雙電壓(-50/70V)的條件下肽段和蛋白鑒定數(shù)目

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繼續(xù)對不同濃度的Hela酶切肽段進(jìn)行測試，Hela的濃度范圍從10ng到1000ng,，跨越3個(gè)數(shù)量級,，在每個(gè)濃度下Exploris 240均能獲得驚人的蛋白鑒定數(shù)。即使在10ng低濃度的上樣量的情況下,，Exploris 240仍然能夠鑒定1600個(gè)蛋白,。

圖6. Exploris 240在不同濃度HeLa digest，90min色譜梯度,，F(xiàn)AIMS Pro 2 CV (-50/-70),， Ionopticks 625px column， Proteome Discoverer™ 2.4 Mspep譜圖庫檢索,，1%FDR的肽段和蛋白鑒定數(shù)目

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需要注意的是，F(xiàn)AIMS Pro在多肽分離上具有*正交性,，如圖7所示,，200ng Hela 30min梯度-50V和-70V鑒定到的肽段中只有3%的肽段是重復(fù)鑒定的。

圖7. 200ng Hela, 30min梯度CV -50V和-70V的肽段的Overlap圖,，只有3%肽段重復(fù)鑒定

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此外,，針對很多蛋白質(zhì)科學(xué)平臺(tái)老師日常工作中常見的IP蛋白鑒定樣品，Exploris 240可以將IP樣品分析的時(shí)間縮短至30分鐘,。免疫富集AKT/mTOR通路中12個(gè)蛋白的樣品在30分鐘梯度內(nèi)就可以鑒定到超過1600個(gè)蛋白,，大大縮短了分析的周期。

圖8. 高通量IP蛋白鑒定,。免疫富集 AKT/mTOR通路的12個(gè)蛋白,，進(jìn)行蛋白酶切，使用15min和30min梯度蛋白質(zhì)鑒定

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2 深度,、精確蛋白質(zhì)定量

定量蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)分析的*手段,，Exploris 240可實(shí)現(xiàn)非標(biāo)記定量（圖9），DIA定量,，TMT定量（圖10）和PRM靶標(biāo)定量（圖11）4種模式,，滿足定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析的多種需求。Exploris 240源于Orbitrap的定量技術(shù)，定量性能可達(dá)amol級別靈敏度,，并實(shí)現(xiàn) 5個(gè)數(shù)量級的線性范圍,。

圖9. Exploris 240非標(biāo)記定量性能。兩種蛋白質(zhì)混合物的精確非標(biāo)記定量,。酵母蛋白消化液以1:10,1:5,1:2的比例加入到200 ng Pierce HeLa消化液標(biāo)準(zhǔn)品的背景中,。在Orbitrap Exploris 240 質(zhì)譜上對兩種蛋白混合物進(jìn)行分析，然后在Proteome Discoverer™2.4軟件中使用Minora feature detector 模塊進(jìn)行LFQ數(shù)據(jù)處理

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圖10. 基于TMT的高準(zhǔn)確度定量的可重現(xiàn)性,。A) 在帶有FAIMS Pro接口的Orbitrap Exploris 240 質(zhì)譜上使用兩種補(bǔ)償電壓(-50和-70 CV),，對500ng TMT 11plex 標(biāo)記的酵母消化標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行60分鐘梯度的定量分析。該標(biāo)準(zhǔn)樣本為用戶提供了一個(gè)工具,，用于不同儀器測量TMT方法的準(zhǔn)確性,、精密度和蛋白質(zhì)組深度的考察。B)所示的是FDR卡值為1%以下的蛋白質(zhì)和多肽的定量數(shù)量,。C)所有重復(fù)的無干擾指數(shù)均達(dá)到75%,。

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圖11. Exploris 240準(zhǔn)確的PRM定量性能。Pull-down AKT/mTOR通路的12個(gè)蛋白,，加入AKT/mTOR SureQuant kit輕標(biāo)和重標(biāo)肽段,，含有30個(gè)高純度的重標(biāo)和輕標(biāo)肽段，進(jìn)行PRM定量分析,。83%肽段CV<10%,，可達(dá)5個(gè)數(shù)量級的動(dòng)態(tài)范圍。

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3 應(yīng)用于臨床大隊(duì)列分析

蛋白組大隊(duì)列分析是很多臨床和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的訴求,，Exploris 240繼承了Exploris 480穩(wěn)定和易用的硬件設(shè)計(jì),，真正做到不停歇的蛋白組分析。今年賽默飛精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心開發(fā)了快速蛋白質(zhì)組分析流程,，自動(dòng)化的樣品前處理每天可以處理500個(gè)樣本,，高通量的LC-MS分析可以實(shí)現(xiàn)60個(gè)樣品/天的通量。

圖12. 大規(guī)模臨床隊(duì)列分析實(shí)驗(yàn)流程,。自動(dòng)化的樣品前處理酶切方法每天可以處理500個(gè)樣本,，1臺(tái)Exploris 240可以實(shí)現(xiàn)60樣品/天的分析速度，分析1000個(gè)樣品只需要18天的機(jī)時(shí),。同時(shí)不同Exploris 240質(zhì)譜之間數(shù)據(jù)結(jié)果具有高度一致性,，實(shí)現(xiàn)多臺(tái)質(zhì)譜同時(shí)分析。

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Exploris 240可以加配FAIMS Pro離子淌度接口,，質(zhì)譜分析中,，F(xiàn)AIMS Pro只選擇特定的肽段離子進(jìn)入質(zhì)譜，阻擋了很多干擾物離子,，大大縮短儀器的維護(hù)周期,，用戶只需要定期對FAIMS Pro進(jìn)行維護(hù)即可,，而維護(hù)FAIMS Pro只需要短短半個(gè)小時(shí)的時(shí)間。賽默飛應(yīng)用開發(fā)團(tuán)隊(duì)比較了在清洗FAIMS Pro前后,，TMT標(biāo)記的蛋白鑒定數(shù)目和IFI指數(shù)幾乎一致,，用戶無需擔(dān)心維護(hù)FAIMS Pro會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性的差異。

圖13. FAIMS Source Pro易于安裝和維護(hù),，同時(shí)支持氣相分離,，并通過去除污染物提高了儀器的可靠性。在清洗FAIMS Pro前后,，蛋白的鑒定數(shù)目和共隔離指數(shù)一致,。

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總結(jié)

Exploris 240是賽默飛蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域繼Exploris 480之后的又一集大成之作，融合了賽默飛的蛋白質(zhì)分析技術(shù),，將蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用方法模板化,，方便用戶使用；同時(shí)在蛋白鑒定數(shù),，定量性能上有優(yōu)異的表現(xiàn),，且充分考慮了大隊(duì)列蛋白質(zhì)組分析中儀器穩(wěn)定性的問題，可以預(yù)見Exploris 240必將成為蛋白質(zhì)組分析*的主力成員,。

重磅 6月16日

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