分秒必爭，賽默飛Orbitrap質(zhì)譜參與xin冠抗疫研究
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賽默飛世爾,，作為抗疫先鋒之一，在背后助力科學(xué)家的研究,，守護(hù)我們的健康 ,，讓世界更安全。
由SARS-CoV-2（2型嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒）引起的xin型冠狀病毒肺炎（COVID-2019）具有高傳染性,，xin型冠狀病毒肺炎在中國和的迅速傳播引發(fā)了衛(wèi)生緊急情況,。ding尖的科學(xué)家針對(duì)xin冠病毒進(jìn)行爭分奪秒的研究,，利用Orbitrap質(zhì)譜技術(shù)參與分析病毒相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)，病毒感染機(jī)制等內(nèi)容,，本文將討論Orbitrap高分辨質(zhì)譜在xin冠病毒感染致病等機(jī)制的亮點(diǎn)研究及技術(shù)進(jìn)展,。
1. 靶向蛋白定量方法監(jiān)測(cè)xin冠病毒蛋白動(dòng)態(tài)變化
Orbitrap Eclipse高靈敏度平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)靶向定量xin冠病毒蛋白
2019年美國質(zhì)譜年會(huì)，賽默飛重磅推出三合一系列的創(chuàng)新之作——Thermo ScientificTM Orbitrap EclipseTM 質(zhì)譜儀,，旨在解決生物學(xué)研究中的分析難題,，輕松應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)，生物制藥與蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)分析研究中的各項(xiàng)挑戰(zhàn),，推出不久即投入到xin冠病毒研究中,。
近，荷蘭鹿特丹伊拉斯馬斯大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)使用 Orbitrap Eclipse檢測(cè)SARS-CoV-2病毒蛋白肽段序列,，作為潛在的診斷工具,。作者利用easy1200液相和Eclipse質(zhì)譜使用靶向方法-平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）追蹤病毒感染Vero細(xì)胞后，幾種SARS-CoV-2蛋白的肽段變化,。作者研究了SARS-CoV-2蛋白PRM實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)限,，主要是核衣殼蛋白（NCAP），這是豐富的病毒蛋白,，因此是比較好的候選測(cè)試分子,。Orbitrap Eclipse 質(zhì)譜的PRM結(jié)果顯示對(duì)該蛋白靈敏度可達(dá)到amol級(jí)別，大約為0.9pg,。粗略計(jì)算表明,，這種靈敏度水平應(yīng)足以檢測(cè)理論上與約10000個(gè)SARS-CoV-2顆粒相對(duì)應(yīng)的蛋白量,。且其他SARS-CoV-2蛋白也是PRM靶向方法的良好候選蛋白[1],。
圖. Orbitrap Eclipse靶向PRM監(jiān)測(cè)SARS-CoV-2病毒蛋白肽段序列
此外作者還在進(jìn)行了整體蛋白質(zhì)組學(xué)分析。在60-90分鐘分析時(shí)間內(nèi),，共鑒定出6500種相關(guān)蛋白質(zhì),。這表明蛋白質(zhì)組學(xué)可以用來研究病毒感染宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)組，是未來新興的研究工具,。
2. 蛋白質(zhì)組學(xué)研究xin冠病毒感染的調(diào)控機(jī)制研究
2.1 Orbitrap 高分辨質(zhì)譜研究病毒宿主相互作用蛋白揭示感染機(jī)制
SARS-CoV-2病毒的基因組有29811個(gè)核苷酸,，可編碼28-29個(gè)蛋白質(zhì)。其中一個(gè)蛋白質(zhì)E 是一種包膜蛋白,，是有助于形成病毒油泡的結(jié)構(gòu)蛋白,。一旦病毒進(jìn)入細(xì)胞，它還有其他的功能,。例如,，附著在蛋白質(zhì)上，有助于打開和關(guān)閉我們自己的基因,。當(dāng)E蛋白干擾時(shí),，模式可能會(huì)改變,。VISTARA BIOSCIENCE研究人員近進(jìn)行一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)E與寄主細(xì)胞中的溴多胺蛋白結(jié)合,。Bromodomain 4（BRD4）是BET亞家族蛋白,，通過識(shí)別乙酰化組蛋白提供了一個(gè)招募平臺(tái)作用,，與非組蛋白靶點(diǎn)相關(guān),，除與病毒蛋白復(fù)合外，還參與NFKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),、Myc調(diào)控,。此外，BRD4還與其它bromodomain蛋白存在協(xié)同作用,，其中一些還可能執(zhí)行泛素化功能,。另有一位作者使用QE HFX質(zhì)譜描述了BRD4相互作用蛋白的分子表型，使用了經(jīng)BET抑制劑,、與BRD4結(jié)合的化合物以及可能的其他bromodomain蛋白處理的人類B細(xì)胞系蛋白質(zhì)組,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，已鑒定的蛋白定位于SARS-CoV-2病毒感染細(xì)胞的相互作用重編程途徑和復(fù)合物中[2],，如下圖所示,。
圖. 蛋白組學(xué)分析SARS-CoV-2病毒感染細(xì)胞后BRD4相關(guān)互作蛋白
2.2. Q Exactive HF質(zhì)譜非標(biāo)定量技術(shù)監(jiān)控病毒感染細(xì)胞實(shí)時(shí)變化
法國巴黎薩克利大學(xué)團(tuán)隊(duì)，通過使用Thermo ScientificTM Orbitrap Q Exactive HFTM質(zhì)譜進(jìn)行niao槍法蛋白質(zhì)組學(xué)研究,，獲得了 SARS-CoV-2感染的相關(guān)信息,，確定了病毒顆粒抗原產(chǎn)生的jia條件,。技術(shù)流程如下圖所示,。
作者用SARS-CoV-2感染Vero E6細(xì)胞（MOI 0.01和0.001）。然后用LFQ（非標(biāo)記定量方法）方法在幾天內(nèi)監(jiān)測(cè)感染的實(shí)時(shí)變化,。總共鑒定了3220個(gè)Vero細(xì)胞蛋白和6個(gè)SARS-CoV-2蛋白,，以及27388個(gè)Vero細(xì)胞和94個(gè)病毒特異肽段（FDR<1%）。病毒蛋白水平在不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化表明,，SARS-CoV-2蛋白合成在感染后持續(xù)增加,，在感染第3天左右達(dá)到大值。為了評(píng)估質(zhì)譜獲得的病毒圖譜在多大程度上反映了病毒的產(chǎn)生,，作者通過qPCR在同一時(shí)間點(diǎn)測(cè)量了SARS-CoV-2 RNA分子,，觀察到了極為豐富的病毒蛋白產(chǎn)量的變化[3]，從而證實(shí)可以使用基于質(zhì)譜的LFQ非標(biāo)定量法監(jiān)測(cè)SARS-CoV-2的感染動(dòng)力學(xué),。
圖. Q Exactive HF質(zhì)譜進(jìn)行niao槍法蛋白質(zhì)組學(xué)研究SARS-CoV-2感染的相關(guān)蛋白
3. Orbitrap高分辨質(zhì)譜針對(duì)xin冠病毒糖蛋白結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展
3.1. Orbitrap Fusion質(zhì)譜結(jié)合冷凍電鏡解析SARS-CoV-2 S糖蛋白多糖結(jié)構(gòu)
來自CCRC的Robert Woods實(shí)驗(yàn)室通過大量實(shí)驗(yàn)生成了 SARS-CoV-2 S糖蛋白上的聚糖三維結(jié)構(gòu),。整個(gè)研究基于所報(bào)道的S蛋白3D結(jié)構(gòu)和相關(guān)的糖組學(xué)數(shù)據(jù)[4]，由賽默飛冷凍電鏡Cryo_EM 以及Thermo ScientificTM Orbitrap FusionTM 質(zhì)譜結(jié)合分析。
他們進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬,，以觀察多糖的微觀異質(zhì)性對(duì)表位暴露的影響,。模糊位置為聚糖結(jié)構(gòu)。M9型（綠色）,，M5型（深黃色）,，混合型（橙色），復(fù)合型（粉色）,。
圖. SARS-CoV-2 S糖蛋白聚糖結(jié)構(gòu)和多糖微觀異質(zhì)性
3.2. Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜繪制xin冠病毒SARS-CoV-2 S蛋白糖基化圖譜
xin型冠狀病毒（SARS-CoV-2）中的刺突蛋白（Spike蛋白）是一種高度糖基化的蛋白質(zhì),，是病毒結(jié)合和進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是研發(fā)抗體及相關(guān)藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn),。該蛋白的位點(diǎn)特異性N-糖基化修飾（包含糖基化位點(diǎn)和糖鏈信息）分析對(duì)于了解其功能和藥物研發(fā)具有重要意義,。四川大學(xué)華西醫(yī)院科研團(tuán)隊(duì)針對(duì)該蛋白的位點(diǎn)特異性N-糖基化修飾進(jìn)行深入分析[5]，具體實(shí)驗(yàn)流程如下,。
圖. 利用Orbitrap質(zhì)譜分析xin冠病毒S蛋白N-糖基化流程
通過使用Thermo ScientificTM Orbitrap FusionTM LumosTM質(zhì)譜技術(shù)的整合糖蛋白質(zhì)組學(xué)新方法,，繪制了xin冠病毒SARS-CoV-2重組表達(dá)蛋白的所有N糖基化修飾位點(diǎn)以及位點(diǎn)特異性的N-糖鏈組成圖譜，如下圖所示,。
圖. S糖蛋白位點(diǎn)特異性N糖基化位點(diǎn)修飾譜
4. 蛋白質(zhì)組結(jié)合代謝組研究xin冠病毒感染病人血清生物標(biāo)志物
多組學(xué)方法研究xin冠肺炎輕重癥患者血清中蛋白和代謝生物標(biāo)志物
西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院與合作團(tuán)隊(duì)對(duì)xin冠肺炎患者血液中的蛋白質(zhì)和代謝物分子進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè),，利用多組學(xué)方法研究重癥患者血清的多種蛋白和代謝物分子表型，尋找潛在生物標(biāo)志物,，有望為預(yù)測(cè)輕癥患者向重癥發(fā)展提供導(dǎo)向,。
實(shí)驗(yàn)對(duì)99例病毒滅活處理的血清樣本進(jìn)行了安全處理和Orbitrap質(zhì)譜分析。根據(jù)現(xiàn)行臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),，樣本被分為對(duì)照（健康）組,、普通流感組、xin冠感染輕癥組,、xin冠感染重癥組,。運(yùn)用QE HF質(zhì)譜對(duì)血清樣本中的蛋白質(zhì)和代謝物的相對(duì)濃度進(jìn)行整體分析[6]，揭示重癥患者體內(nèi)多種分子調(diào)控,，具體流程如下圖所示,。
圖. 蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合代謝組學(xué)圍繞xin冠肺炎患者隊(duì)列進(jìn)行分析流程
與對(duì)照（健康）組、普通流感組和輕癥組相比,，xin冠肺炎重癥患者的樣本中出現(xiàn)了93種*的蛋白表達(dá)和204個(gè)特征性改變的代謝分子。其中50種蛋白,，與患者體內(nèi)的巨噬細(xì)胞,、補(bǔ)體系統(tǒng)、血小板脫顆粒有關(guān),。研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn),，在xin冠病毒感染的重癥患者體內(nèi)，有100多種氨基酸及100多種脂質(zhì)均顯著減少。見下圖,。
圖. COVID-2019感染后重癥患者體內(nèi)的巨噬細(xì)胞等通路蛋白質(zhì)和代謝物變化
基于Orbitrap質(zhì)譜技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)分析方法,，短時(shí)間內(nèi)整合蛋白質(zhì)組、臨床,、生物,、代謝組、計(jì)算等多學(xué)科數(shù)據(jù)篩選出重癥患者特征性的22個(gè)蛋白質(zhì)和7個(gè)代謝物,，有望可以輔助現(xiàn)有的診斷分析手段,，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)、高效的治療,。
xin型冠狀病毒肺炎疫情來勢(shì)洶洶,，牽動(dòng)著每一個(gè)人的心，在這沒有硝煙的抗疫戰(zhàn)場(chǎng)上,，白衣天使和醫(yī)學(xué)研究者都是勇敢的戰(zhàn)士,。賽默飛也在以自己的力量全力支持國內(nèi)的xin冠病毒科學(xué)研究，我們整理了基于Orbitrap超高分辨質(zhì)譜技術(shù)在xin冠病毒相關(guān)的亮點(diǎn)研究,，謹(jǐn)以此文致敬白衣天使和深耕醫(yī)學(xué)研究的學(xué)者們,，默默付出，勇敢向前,。
參考文獻(xiàn)
[1] TARGETED PROTEOMICS FOR THE DETECTION OF SARS-COV-2 PROTEINS, https://www.biorxiv,。。ｏｒｇ/content/10.1101/2020.04.23.057810v1
[2] A proteomic model of SARS-COV2 infection by comparing the interactomes of BRD4 with BET-inhibition and SARS-COV2 viral proteins – implications for re-purposing approved drugs or ubiquitin-mediated degradation of select candidates,，DOI:10.21203/rs.3.rs-24573/v1
[3] Shotgun proteomics of SARS-CoV-2 infected cells and its application to the optimisation of whole viral particle antigen production for vaccines, https://www.biorxiv,。。ｏｒｇ/content/10.1101/2020.04.17.046193v1
[4] 3D Models of glycosylated SARS-CoV-2 spike protein suggest challenges and opportunities for vaccine development, doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.07.030445
[5] Site-specific N-glycosylation Characterization of Recombinant SARS-CoV-2 Spike Proteins using High-Resolution Mass Spectrometry, https://doi.org/10.1101/2020.03.28.013276.
[6] Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-2019 Patient Sera, https://www.medrxiv,。,。ｏｒｇ/content/10.1101/2020.04.07.20054585v1
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