二硫鍵對于穩(wěn)定蛋白質(zhì)藥物的空間結(jié)構(gòu),， 保持其活性具有重大的作用。而在蛋白質(zhì)藥 物的生產(chǎn)過程中,，由于成本控制的需求,，往 往追求較大的蛋白質(zhì)表達(dá)濃度，而使發(fā)生二 硫鍵錯配(disulfide scramble)的可能性有所上 升[1] ,。因此,，二硫鍵的連接確證成為蛋白質(zhì)藥 物質(zhì)量表征的必須環(huán)節(jié)。相對于對角線電泳 法,、突變分析法,、部分還原測序法，以及X晶 體衍射和核磁共振等技術(shù),，串聯(lián)質(zhì)譜在靈敏 度,、準(zhǔn)確性、操作性等多方面*優(yōu)勢,，已 經(jīng)成為二硫鍵表征的主流方法[2] ,。早期的二硫 鍵液質(zhì)分析，采用人工對比還原與非還原肽 圖數(shù)據(jù)策略（圖1）,，來確定二硫鍵,。這種策 略的靈敏度差,、分析通量低、不同分析人員 造成的分析結(jié)果差異較大,。近年隨著質(zhì)譜及 軟件技術(shù)的迅猛發(fā)展,，目前二硫鍵分析工作， 已經(jīng)進(jìn)入了直接分析階段,，也就是直接采集 非還原蛋白質(zhì)藥物肽圖串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù),，并通 過化軟件自動化查找二硫鍵。
在二硫鍵的質(zhì)譜分析中,，碰撞誘導(dǎo)解離 （CID）與高能碰撞解離（HCD）是普遍的二級碎裂方法,。使用HCD/CID作為采集二硫鍵 數(shù)據(jù)的優(yōu)點主要有：碎片信號較豐富，且強(qiáng) 度較均勻,，采集頻率快,，以及儀器價格經(jīng)濟(jì)。 圖2為鏈間,、鏈內(nèi)以及復(fù)合型二硫鍵連接肽段 的二級碎片圖譜示例[3] ,。
蛋白質(zhì)藥物二硫鍵分析主要有兩種需求， 分別是1）對期望二硫鍵連接的驗證,；2）對 未知（錯配）二硫鍵的發(fā)現(xiàn),。在針對種 需求進(jìn)行分析時，一般會將預(yù)期的二硫鍵連 接方式輸入軟件,。分析軟件僅是在提供的連 接方式中尋找是否有匹配的質(zhì)譜信號,。第二 種需求則是在僅提供蛋白氨基酸序列的情況 下，對未知（錯配）二硫鍵進(jìn)行發(fā)現(xiàn)鑒定,。 由于蛋白質(zhì)中存在眾多的半胱氨酸,，而任意 兩個半胱氨酸都存在形成二硫鍵的可能性， 加之考慮到可能存在的非特異性酶切以及可 變修飾等因素,，致使各種連接可能性的數(shù)目 以組合爆炸的規(guī)模出現(xiàn),。面對這種嚴(yán)酷的分 析要求，軟件需具有*大的數(shù)據(jù)處理性能,。
軟件已經(jīng)成為二硫鍵分析的關(guān)鍵一環(huán),。其中專門針對Orbitrap系列質(zhì)譜碎裂特點所設(shè)計 的軟件種類多，如pLinks[3,4] ,、StavroX[5] 等,， 這也從一個側(cè)面說明了Orbitrap型質(zhì)譜在二硫 鍵分析中已被為廣泛地應(yīng)用。在這些軟件 中,，較為出色的如pLinks具有了令人振奮的數(shù) 據(jù)分析性能,。在進(jìn)行錯配二硫鍵發(fā)現(xiàn)時， pLinks可在考慮肽段N、C兩端都為非特異性酶 切,，并含可變修飾條件下,，在幾分鐘內(nèi)就可 完成二硫鍵數(shù)據(jù)檢索。Thermo 新近推出的 PepFinder作為整合的生物制藥軟件分析平臺,， 同樣具備了未知二硫鍵檢索功能,，為分析人 員的工作提供了極大的便利。
需要指出的是,，二硫鍵分析實驗由于需要 在不*對蛋白質(zhì)進(jìn)行變性（不還原二硫鍵） 的情況下進(jìn)行,，酶切相對普通肽圖分析（蛋 白質(zhì)被充分變性后酶切），較難一次得到理 想的酶切效果,，因此在樣品處理方面，需要 根據(jù)不同的樣品,，摸索和優(yōu)化樣品處理方法,。 考慮的因素包括：酶切的時間、多酶酶切選 擇[6] ,，減少堿性環(huán)境,、封閉自由半胱氨酸以避 免引入錯配二硫鍵等等 [3,7] 。這些都是在實驗 設(shè)計及結(jié)果分析中需要特別注意的方面,。
此外,，二硫鍵分析還具有一般肽圖分析不 具有的復(fù)雜性，如：鏈內(nèi)二硫鍵[8] ,、多對以上 二硫鍵結(jié)構(gòu) （ 如 cystine Knot and nested disulfide）[6] ,、糖肽形與二硫鍵同時存在[9] 、通 過二硫鍵形成的環(huán)肽[10] 等,。在這些情況下,， 單純使用一種碎裂方法所獲得的信息有限， 因此ETD與MSn等質(zhì)譜技術(shù)就成為了CID/HCD技 術(shù)的有效補(bǔ)充,。
ETD技術(shù)作為與CID/HCD并列的多肽碎裂 技術(shù),，其碎片特性與后兩者有著明顯的不同。 在二硫鍵碎裂方面,，明顯的差異就是,， CID/HCD無法打開二硫鍵，以及含鏈內(nèi)二硫肽 段在兩個半胱氨酸之間的序列區(qū)域無法產(chǎn)生碎片,。而ETD在這兩種情況下都可以產(chǎn)生碎片 [11] ,。如圖X。顯而易見,，ETD與CID/HCD產(chǎn)生的 碎片信息互補(bǔ)性*,，綜合使用將非常有利 于終得到可信的結(jié)果[7] 。
多級質(zhì)譜也是針對復(fù)雜二硫鍵分析時可以 選擇的一種方法。Wu等使用ETD對含二硫鍵 肽段進(jìn)行二級碎裂后,，根據(jù)其碎片特點進(jìn)行 CID-MS3碎片采集（圖4）,，得到了更豐富的碎 片信息，這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種蛋白 質(zhì)藥物產(chǎn)品的分析中[7,，12] ,。
在ETD與MSn聯(lián)用的方法中，對于一級質(zhì) 譜中發(fā)現(xiàn)的母離子,，平行進(jìn)行CID與ETD二級 信息采集,。通過兩種碎裂方式產(chǎn)生碎片互補(bǔ) 性，可得到更為充分的序列信息,。此外,，對于鏈間二硫鍵，由于ETD自身特點,，在ETD的 二級碎片中,，常常會出現(xiàn)兩種強(qiáng)信號。 種強(qiáng)信號是由單純的二硫鍵斷裂（兩條肽段 分離,，但都各自保持完整,，表示為Pep1和 Pep2）產(chǎn)生的。在這種情況下,，可以分別針 對Pep1和Pep2采集三級CID碎片,。這樣就可以 分別得到兩個肽段各自清晰的碎片信息。顯 而易見,，相對于兩種肽段混在一起的MS2碎片,， MS3碎片信息更具針對性，從而大大提高了其 鑒定可信度,，與碎片覆蓋度,。二級ETD經(jīng)常產(chǎn) 生的另一種強(qiáng)信號，表面上看是一級母離子 減少電荷的形式,。而其中實際包含了1）已發(fā) 生碎裂,，但Pep1與Pep2仍通過非共價鍵粘附 在一起的形式，以及2)真正的單純減少電荷離 子形式,。對于后者,，可以通過增加活化能以 及MS3、MS4等方法,，進(jìn)一步挖掘序列信息,。
串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)藥物二硫 鍵分析重要的手段,。在Orbitrap及離子阱質(zhì) 譜高質(zhì)量的數(shù)據(jù)條件下,，加之軟件技術(shù)的巨大發(fā)展，使得二硫鍵檢索分析實現(xiàn)了快速、 準(zhǔn)確,、高通量的要求,，從而使二硫鍵分析進(jìn) 入了常規(guī)化分析時代。
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