在蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品的質(zhì)控要求中，需要對(duì) 蛋白氨基酸序列進(jìn)行確證,，對(duì)相關(guān)修飾進(jìn)行 鑒定以及定量——即肽圖分析,。肽圖的液質(zhì)實(shí) 驗(yàn)流程主要包括：蛋白的變性、二硫鍵的還 原與烷基化,、以及蛋白酶酶解（通常使用胰 蛋白酶 Trypsin）,、液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù) 處理幾個(gè)步驟（圖1）,。在這個(gè)流程中,， Orbitrap 型質(zhì)譜以其超高分辨、高質(zhì)量精度,、 高靈敏,、高穩(wěn)定性成為業(yè)內(nèi)推崇的質(zhì)譜分析 平臺(tái)。除此之外,，考慮到生物制藥應(yīng)用的特 殊需求 ,， 根據(jù)蛋白藥物質(zhì)譜分析特點(diǎn) ， Thermo Fisher與世界制藥企業(yè)Amgen聯(lián) 合開發(fā)了 PepFinderTM 軟 件 ,。 實(shí)際上 ,， PepFinder來源于Amgen內(nèi)部的自制的肽圖分 析軟件，因此其功能設(shè)計(jì)從一開始就聽從了 一線分析人員的切實(shí)需求 [1,2] ， 而 Thermo Fisher的加入,，則使軟件底層對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理 的性能大大提高。因此,，PepFinder一經(jīng)公開 發(fā)布,，就受到了業(yè)內(nèi)的極大關(guān)注與好評(píng)。
除基本的肽段序列確認(rèn),、覆蓋率分析,、 修飾位點(diǎn)鑒定與定量、錯(cuò)配二硫鍵發(fā)現(xiàn),、圖 譜對(duì)比,、CID/HCD/ETD碎片解析等功能外， PepFinder還*未知修飾發(fā)現(xiàn),、氨基酸突變 查找功能[1-5] ,。這兩項(xiàng)功能可以幫助大家快速 發(fā)現(xiàn)序列變異，避免可能出現(xiàn)的巨大的質(zhì)量 風(fēng)險(xiǎn),。不僅如此,，PepFinder還有更多貼心的 功能設(shè)計(jì)，如內(nèi)置了CHO細(xì)胞系糖型,，并可一 鍵選擇進(jìn)入糖肽分析流程,；再如，除具有肽 段鑒定可信度評(píng)價(jià)功能外,，還可智能顯示多 肽的理論質(zhì)譜碎片,，并用于與實(shí)驗(yàn)圖譜直觀 對(duì)比，以輔助分析,，并可快速提高分析員質(zhì) 譜解析水平,。這些功能不但減少工作強(qiáng)度， 也降低了對(duì)分析員理解質(zhì)譜數(shù)據(jù)深度的要求[6- 11] ,。更具情懷的是,，對(duì)于氨基酸固定修飾設(shè)置， 不同于其它類似軟件（固定修飾只可至 某一類氨基酸）,，在PepFinder中,，可以 到特定的某個(gè)氨基酸位點(diǎn)。此功能對(duì)于蛋白 藥的某些特殊分析需求提供了極大的便利,。
圖2為PepFinder的氨基酸序列鑒定覆蓋率 結(jié)果顯示圖 ,。 相較于其它類似軟件 ， PepFinder的覆蓋率顯示方法更適用于蛋白藥 物肽圖分析,，其中不僅包括了結(jié)果總結(jié)與具 體的鑒定情況,，還含有鑒定序列的色譜保留 時(shí)間與強(qiáng)度信息。這些便捷的信息顯示為某 些情況下的肽圖方法開發(fā)，指出了優(yōu)化方向,。修飾的鑒定與定量也是肽圖分析中的必須 項(xiàng)目,。Orbitrap具有的靈敏度與準(zhǔn)確性， 配合PepFinder軟件,，使此項(xiàng)分析工作不再繁 重,。圖3中，為一蛋白藥物某肽段中色氨酸殘 基(W)的正常形式與雙氧化形式的二級(jí)鑒定圖 譜,。其中雙氧化形式肽段豐度僅為總量的 0.13%,，但仍得到了高質(zhì)量的碎片與定量信息。
圖4為另一常見的多肽修飾——脫氨基 (deamidation),。在此例中,，同一個(gè)肽段內(nèi)含有 兩個(gè)天冬酰胺(N)，通過液質(zhì)分析,，不但實(shí)現(xiàn) 了對(duì)脫酰胺化肽段的鑒定與定量,，而且對(duì)于 不同位置的脫酰胺化，Orbitrap都采集到了高 質(zhì)量的二級(jí)碎片信息,，使之得以分辨,。
圖5顯示了針對(duì)蛋白質(zhì)藥物分析的一些特 殊參數(shù)設(shè)置，如二硫鍵檢索,、CHO細(xì)胞系糖肽 檢索,、未知修飾發(fā)現(xiàn)、氨基酸突變鑒定等功 能,。這些功能有助于提高分析人員的工作效 率,，降低數(shù)據(jù)分析難度，更可以幫助及時(shí)發(fā) 現(xiàn)可能導(dǎo)致蛋白藥物質(zhì)量問題的潛在風(fēng)險(xiǎn),。
質(zhì)控部門的工作要求其成員能熟練進(jìn)行 多種不同的分析實(shí)驗(yàn)操作,。相對(duì)于其它技術(shù) 而言，質(zhì)譜分析更為復(fù)雜,，難度相對(duì)較大,。 為了提升工作效率、降低質(zhì)譜使用進(jìn)入門檻,， Orbitrap系列質(zhì)譜采用了盡可能簡化的操作界 面設(shè)計(jì),，即使沒有質(zhì)譜操作經(jīng)驗(yàn)的人員，也 可以在一個(gè)工作日內(nèi)掌握儀器的日常維護(hù),、 校正,、采集方法設(shè)置等操作。但是對(duì)于質(zhì)譜 數(shù)據(jù)分析工作來說,，不可能一蹴而就,，而是 需要經(jīng)驗(yàn)積累的,。為了幫助使用者能更快地 具備豐富的質(zhì)譜分析經(jīng)驗(yàn)，PepFinder特意設(shè) 置了理論圖譜功能（圖6）,。此功能可根據(jù)肽 段的氨基酸序列,，通過Kinetic Model計(jì)算出肽 段的理論碎片圖譜[6-11] ，并與實(shí)驗(yàn)圖譜對(duì)比顯 示,。這樣就為實(shí)驗(yàn)人員提供了為直觀的質(zhì)譜圖譜觀察途徑,，可輔助判斷圖譜質(zhì)量，并 可幫助分析者快速積累質(zhì)譜分析經(jīng)驗(yàn),。
肽圖分析是蛋白質(zhì)藥物研發(fā)及質(zhì)控為常 用的分析手段之一。其可以提供為精細(xì)的 序列結(jié)構(gòu)及修飾信息,，因此參與到了細(xì)胞株 篩選,、細(xì)胞培養(yǎng)、純化,、制劑工藝優(yōu)化等各 個(gè)階段,。在每次分析中，都需要從肽圖數(shù)據(jù) 中挖掘出大量重要的信息,，使其成為質(zhì)控與 研發(fā)分析中較為繁重的一項(xiàng)工作,。PepFinder 直接基于Amgen的一線分析需求進(jìn)行設(shè)計(jì)開發(fā)， 并經(jīng)過了多年的內(nèi)部使用,，因此成為蛋白藥 物質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析中的軟件,。 PepFinder與Orbitrap系列質(zhì)譜的聯(lián)合運(yùn)用已成 為業(yè)內(nèi)*的實(shí)驗(yàn)分析平臺(tái)。
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