關鍵詞 Q Exactive HF,， DDA，DIA,，293T,，定量蛋白質組學 數(shù)據(jù)非依賴性的掃描模式（data-independent acquisition， DIA）是近幾年來發(fā)展的一種新的質譜數(shù)據(jù)采集方式(1),。 DIA 掃描模式中,，超高分辨質譜對特定質量范圍內的所有 母離子進行碎裂，采集所有母離子的碎片離子,，并快速地 依次掃描相鄰的母離子窗口內的所有碎片離子,。DIA 的數(shù) 據(jù)中包含了所有碎片離子的保留時間和強度信息。用非常 小的質量偏差窗口（如 10 ppm）目標性地抽提同一肽段 的多個子離子,，計算子離子的強度,，就能對該肽段進行鑒 定和定量。 DIA 定量相比傳統(tǒng)的基于母離子強度的 DDA 定量有選擇性好,，定量準確等優(yōu)點,，所以 DIA 成為定量蛋 白組學新的熱門發(fā)展方向 (2)。
Q Exactive HF 是賽默飛世爾科技在 2014 年的 ASMS 上 推出的全新靜電場軌道阱超高分辨質譜儀 (3, 4),。Q Exactive HF 采 用 了 分 段 式 四 極 桿 技 術（Advanced Quadrupole Technology,，AQT）使離子傳輸效率至少提高了 2 倍；超 高場 Orbitrap 技術,，提高了 Orbitrap 掃描速度,，在 15000 分辨率時，二級譜圖的掃描速度是 18 Hz,。這兩項技術提 高了 Q Exactive HF 進行 DDA,、DIA 數(shù)據(jù)的采集能力。本 文用 Q Exactive HF 質譜,，170 min 色譜梯度對 293T 細胞 蛋白質組進行 DIA 定量分析,，考察 Q Exacive HF DIA 定 量的能力。
實驗條件 實驗材料和方法 293T 細胞裂解液酶切肽段,，樣品中加入 iRT 肽段用于保 留時間校正,，DDA 和 DIA 數(shù)據(jù)采集，每種采集模式平行 進行三次技術重復,，DDA 用于構建譜圖庫,，DIA 用于定量 分析,。
NanoLC 液相色譜儀：Thermo Scientific Easy-nLC 1000；色 譜柱：analytical column（C18,，3 µm,，100Å，75μm x 20 cm）,；流動相：A：0.1% Formic acid in water,； B：0.1% Formic acid in Acetonitrile；梯度： 3% - 8% B in 4 min,， 8%-30% B in 153 min,，30%- 90% B in 10 min，90%- 90% B in 3 min,；流速：300 nL/min
質譜分析 DD 模式： 質譜儀：Thermo Scientific Q Exactive HF,；噴霧電壓：2.1 kV；毛細管溫度：275 ℃,；S-lens：60% ,；碰撞能量： 27% HCD；分辨率設置：一級 60,000@m/z 200,，二級 15,000@m/z 200,；Max IT ：full MS 20ms,，full MS/MS 45 ms,；母離子掃描范圍：m/z 350-1500；子離子掃描范圍： start from m/z 120,；Data-dependent MS/MS：Top 20,； Isolation window：1.6 Da；dynamic exclusion：35s
DIA 模式： 質 譜 儀：Thermo Scientific Q Exactive HF,； 噴 霧 電 壓： 2.1 kV,；毛細管溫度：275 ℃；S-lens：60% ,；碰撞能 量：27% HCD,；分辨率設置：一級 60,000@m/z 200，二 級 30,000@m/z 200,；Max IT：full MS 20 ms,，full MS/MS 45 ms；母離子掃描范圍：m/z 350-1200,；子離子掃描范圍： start from m/z 120,；窗口數(shù)目：40；隔離窗口：20 Da
數(shù)據(jù)處理 DDA 數(shù)據(jù)采用 Proteome Discoverer 2.1 進行蛋白鑒定,， 數(shù)據(jù)處理流程：Sequest HT 搜庫引擎,；人蛋白數(shù)據(jù)庫 （uniprot human_201309）,，母離子質量偏差：10 ppm； 碎片離子質量偏差：0.02 Da,；固定修飾：半胱氨酸烷基 化（+57.021 Da）,；動態(tài)修飾：甲硫氨酸氧化（+15.995 Da）； 酶：trypsin,； 漏 切 位 點：2,；peptide FDR<0.01； protein FDR<0.01 DIA 數(shù)據(jù)采用 Spectronaut (2) 軟件進行 DIA 蛋白定量：1） 建立譜圖庫：Proteome Discoverer 2.1 數(shù)據(jù)檢索生成的 pdresult 文件導入 Spectronaut 建立譜圖庫,； 每個肽段 少含有 3 個碎片離子,，多含有 6 個碎片離子；碎片離 子的 m/z 范圍是 300-1800,；2）原始文件格式轉化：將 Raw 文件格式轉換成 htrms 格式的文件,；3）DIA 數(shù)據(jù)峰 抽提，導入 DIA 數(shù)據(jù),，設定譜圖庫,，控制 q<0.01。
實驗結果 1. DDA 鑒定結果以及譜圖庫建立 取 293T 細胞裂解液酶切肽段約 1 µg 進行 170 min 色譜 梯度的 DDA 數(shù)據(jù)采集,，為了獲得較全面的譜圖庫,，DDA 實驗平行進行三次技術重復。3 組 DDA 數(shù)據(jù)用 Proteome Discoverer 2.1 進行數(shù)據(jù)檢索,，控制 peptide FDR<0.01,， protein FDR < 0.01，一共鑒定到 90,202 個肽段,，6496 個 蛋白,，平均一個蛋白鑒定到 15 個肽段，顯示 Q Exactive HF 進行蛋白鑒定實驗能獲得較好的蛋白序列覆蓋率,。 將 Proteme Discoverer 2.1 檢索生成的 pdresult 文件導入 Spectronaut 建立譜圖庫,，該譜圖庫格式是 kit 文件，用于 Spectronaut DIA 峰抽提,。在建立譜圖庫時,，篩選每個肽 段至少包含 3 個碎片離子，多包含 6 個碎片離子,，碎片 離子的m/z 300-1800,。譜圖庫中一共含有 656,678 個碎 片離子，87,743 個肽段,，6,270 個蛋白,。
2. DIA 定量分析 相同的 293T 樣品用于 170 min 色譜梯度的 DIA 數(shù)據(jù)采 集，并且平行進行 3 次技術重復，考察 DIA 的定量能力和 CV,。圖 1 是 3 次 DIA 實驗的 Base peak 圖,，保留時間和 響應均一致，顯示出較好的色譜穩(wěn)定性,。較好的色譜穩(wěn)定 性是獲得可信非標記定量結果的前提,。 3 次 DIA 實驗分別能夠抽提到 77,695 個肽段，6,028 個 蛋白,；77,673 個肽段,，6,042 個蛋白；77,556 個肽段,， 6,019 個蛋白（表 1）,。DIA 能夠鑒定到譜圖庫中 88% 的 肽段，96.7% 的蛋白,，顯示 DIA 具有較高的分析通量,。三 次 DIA 實驗肽段的 median CV 7.5%，蛋白的 median CV 4.3%,，顯示出 DIA 具有非常好的重現(xiàn)性以及定量的準確 性,。DIA 提峰的質量精度在經(jīng)過校正后能夠達到 3 ppm， 顯示 Orbitrap 具有較高的質量精度,。DIA 數(shù)據(jù)處理的方法 就是對目標肽段的碎片離子進行色譜峰抽提,，Orbitrap 能 將質量抽提窗口縮小到 3 ppm，那么基于 Oribtrap 的 DIA 就能獲得較好的選擇性（圖 2）,。 TPA（Total Protein Amount）方法可以進行每個蛋白豐度 的估計（5）,， 假設總的上樣量是 1 µg。通過計算,，豐度高的蛋白是 Histone H2B type 1-L,，柱上濃度是 4631 pmol,。豐度低的蛋白是 Sister Chromatid cohesion protein DCC1,，柱上濃度是 6 fmol。豐度低和豐度高的蛋白相差 5 個數(shù)量級,，顯示 Orbitrap 具有非常寬的 動態(tài)范圍,。
結論 相叫于傳統(tǒng)的 DDA 定量，DIA 作為新的 label free 定量 方法,，具有重現(xiàn)性好,、受干擾小、定量準確等優(yōu)點,。通 常 DIA 采取 1D LC-MS/MS 的分析方法,，因此獲得較多 的定量蛋白數(shù)目是非常大的挑戰(zhàn)。目前文獻報道的 DIA/ SWATH 能定量到的人細胞系的蛋白數(shù)目在 2000-4000 左 右，遠遠低于 SILAC,TMT 等標記定量的通量 (6),。本文基 于新的 Q Exactive HF 質譜,，以 293T 細胞裂解液為模 型考察 DIA 定量蛋白的能力。首先對 293T 細胞裂解液酶 切肽段建立譜圖庫,，鑒定到 87743 個肽段,，6270 個蛋白， 然后用 DIA 對 293T 細胞裂解液酶切跳段進行定量分析,。 使用 170 min 的梯度,，DIA 就能定量到 77000 個肽段， 6000 個蛋白,，顯示出基于 Orbitrap 的 DIA 具有非常高的 定量通量
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