引言 ：藍藻，又名藍綠藻或藍細菌,。一般認為,，藍藻是地球 上早進行光合放氧的生物。藍藻可以進行光合作用,，與 高等植物葉綠素具有一定程度上的同源性,，加上其研究體 系簡單，長期以來一直是研究光合作用的模式生物,。除此 之外,，藍藻還可以進行固氮作用，將大氣中的氮氣經固氮 作用轉化為可以利用的氮源,，用于提高土壤的肥力,。隨著 人們對于光合作用認識的加深，以及對自身生活環(huán)境狀況 的重視,，加上藍藻遺傳體系簡單,、生長速度快、培養(yǎng)方便 等,，相關方面的研究已經引起越來越多的重視,，藍藻已經 成為一種重要的生理生化應用研究模式生物。由于藍藻具 有高光效,、生長速度快,、遺傳操作體系相對成熟，適用大 通量的基因工程改造等一系列傳統(tǒng)優(yōu)勢，因此,，如果可以 通過代謝工程改造藍細菌生產蔗糖并提供給大腸桿菌等微 生物發(fā)酵生產生物燃料,，必將加速整個生物燃料的產業(yè)化 進程，具有顯著的意義,。我們通過此種方法測定藍藻發(fā)酵 液中的一些成分,，如蔗糖、乳糖,、葡萄糖,、海藻糖、葡萄 糖甘油酯,、甘露糖,、果糖等，有利于了解其基因改造效 果,，對于充分利用藍藻意義重大,。 本實驗采用離子色譜質譜聯(lián)法分離測定7種糖，分離 度好,，靈敏度高,，操作簡便，建立了一種有效檢測藍藻發(fā) 酵液中游離糖的方法,。
測試條件： 儀器：ICS-4000色譜儀（Thermofisher公司）,，配四 元梯度泵，AS-AP自動進樣器, MSQ單四極質譜（ESI源） 色譜柱：CarboPac PA 20 保護柱6.5 µm, 35×0.4 mm,，( P/N: 072073) CarboPac PA 20 分離柱6.5 µm, 150×0.4 mm,，( P/N: 072072) 柱溫：30℃； 淋洗液：KOH等度淋洗流速：10 µL /min,； 定量環(huán)：0.4 µL,； 檢測方式：質譜檢測（正離子模式加鈉峰） 質譜條件：柱后加液NaAC (1 mmol/L) : 乙腈(50 :5 0),， 流速20 µL/min
樣品前處理 取發(fā)酵液樣品,，于離心機中離心20分鐘(3000 rpm)， 上清液稀釋適當倍數后,，過RP柱和0.22 µm尼龍濾膜過 濾,，取續(xù)濾液直接上機分析。 結果和討論 色譜柱的選擇及淋洗液梯度條件優(yōu)化 在常規(guī)離子色譜上CarboPac PA 20的糖柱上采用 NaOH/NaOAc梯度淋洗的方式,，能夠將上述7種糖*分 離,，且色譜行為良好，在ICS 4000單泵條件下,，也可利 用KOH梯度將上述幾種糖分離,，但其分析和平衡時間較 長。在質譜條件下可利用分子量的不同,，選擇不同的離子通道對7種糖進行定性和定量,。為了保證色譜峰的分離度 和保留時間的合理性,，我們選擇CarboPac PA 20的糖柱 和KOH等度淋洗的方式。 在上述色譜條件下7種糖的色譜 圖如下圖（圖1. 總離子流圖,，圖2. SIM圖）,。
線性和靈敏度 將標準品定量混合，并將標準品溶液稀釋得到一濃度 系列,，對上述系列濃度各測定,，以峰面積為縱坐標，標準 液質量濃度為橫坐標建立標準工作曲線,，以葡萄糖甘油酯 為例,，其在0.02 mg/L 10 mg/L范圍內線性良好，其回歸 方程,、相關系數如表1所示,。
結論： 離子色譜分離脈沖安培檢測器測定糖分離度好靈敏度 高，在糖類物質的研究中應用非常廣泛,。毛細管離子色譜 常用色譜柱直徑為0.4 mm,，流速為10 µL/min，其進樣體 積通常為0.4 µL,，與常規(guī)分析型離子色譜相比,，其靈敏度 是常規(guī)離子色譜的近百倍，且,。毛細管離子色譜的流速 是10 µL/min,，符合質譜對低流速的需求；且經過抑制器 后,，淋洗液中的鉀離子被交換到廢液中,，進入質譜的流動 相基本為水，與質譜具有很好的兼容性,，在需要進行定性 研究時可連接質譜,。并且在進入質譜前，可以通過一個三 通引入部分乙腈以增加質譜的霧化效率,，增加儀器的穩(wěn)定 性,。本方法在柱后乙腈溶液中添加了少量乙酸鈉，以提高 糖在質譜中的重現(xiàn)性,。毛細管離子色譜質譜聯(lián)用測定糖方 法操作簡便,，重復性好，線性范圍內相關性好,，準確度 高,，進一步拓展了毛細管離子色譜的應用范圍，具有較高 的實用價值。
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