1.有機(jī)溶劑的等級(jí)

應(yīng)選用HPLC級(jí)的有機(jī)溶劑,。

2.溶劑前處理

過濾

過濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒,，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液時(shí),。

濾膜類型：

聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑,，酸和鹽。

醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑,，特別適用于水基溶劑。

尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液,，可以用于強(qiáng)酸,，不適用于二甲基甲酰胺。

再生纖維素濾膜：蛋白吸收低,，同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑,。

脫氣

脫氣：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡

氣泡對(duì)測定的影響：

（1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積

（2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流,，峰變形

（3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng)

脫氣方法：

1,、超聲脫氣

2、減壓脫氣

3,、在線脫氣

3,、樣品前處理

（1）使用流動(dòng)相溶解樣品

--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)尤為重要

--保證樣品在流動(dòng)相中的溶解度,，避免樣品在系統(tǒng)中,，

尤其在柱中產(chǎn)生沉淀

（2）進(jìn)樣前使用0.45um 的濾膜進(jìn)行過濾，

如果樣品很臟,，要使用0.22um的濾膜進(jìn)行過濾,。

（3）對(duì)于含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品,，前處理后再進(jìn)樣。

4,、進(jìn)樣

（1）進(jìn)樣器

•自動(dòng)進(jìn)樣器

•手動(dòng)進(jìn)樣器原理：（六通閥）注入方式：1）全量注入2）部分注入

（2）手動(dòng)進(jìn)樣器的原理圖

•部分注入：一般要求進(jìn)樣量zui多為定量環(huán)體積的一半,，如20μl的定量環(huán)zui多進(jìn)樣10μl的樣品，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確,、相同,。

•全量注入：進(jìn)樣量zui少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20μl的定量環(huán)zui少進(jìn)樣60至100μl的樣品,，這樣才能*置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液,，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。

5,、洗脫

（1）等度洗脫

（2）梯度洗脫

使用梯度洗脫的原因：

梯度洗脫要點(diǎn)：

梯度洗脫：

優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度,、縮短分離時(shí)間、降低zui小檢測量和提高分離精度

注意事項(xiàng)：

（1）溶劑的純度要高,，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差,。

（2）梯度混合的溶劑互溶性要好。

（3）梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如

紫外吸收檢測器或熒光檢測器）,，而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變

化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）,。

（4）查看空白實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。

（5）遵守分析周期（zui初的分析數(shù)據(jù)不采用）,。

6,、色譜柱的類型及適用范圍