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液相色譜柱的使用
色譜柱在使用前,，進行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來,，作為今后評價柱性能變化的參考,。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是*條件)，只有這樣,，測得的結(jié)果才有可比性,。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相,、柱溫等條件的差異而有所不同,。
1、樣品的前處理
a,、使用流動相溶解樣品,。
b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì),。
c,、使用0.45µm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2,、流動相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的,，
因此要求流動相具備以下的特點：
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力,，保證樣品組分不會沉淀在柱中
(或長時間保留在柱中),。
b、流動相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)
c,、流動相的黏度要盡量小,，以便得到好的分離效果；降低柱壓降,，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度),。
d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng),。如使用UV檢測器,，使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e,、流動相沸點不要太低,，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進行。
f,、在流動相配制好后,，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測,，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用,。
3、流動相流速的選擇
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù),，使用不同的流速可得到不同的柱效,。對于一根特定的色譜柱要追求*柱效，使用*流速,。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,，流速一般選擇1ml／min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱,，流速0.8ml／min為佳,。
當選用*流速時，分析時間可能延長,?？刹捎酶淖兞鲃酉?的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量),。
注意：
a．含水流動相在實驗前配制,，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要隔夜。加入*,，防止細菌生長,。
b．流動相要求使用0.45µm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì),。
c．使用HPLC級溶劑配制流動相,，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能,。
色譜柱的維護
注意：
a．含水流動相在實驗前配制,，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要隔夜。加入*,，防止細菌生長,。
b．流動相要求使用0.45µm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì),。
c．使用HPLC級溶劑配制流動相,，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能,。
1.色譜柱的維護
甲醇或乙腈沖洗色譜柱,。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶,。每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱,，您就會在處理問題方面獲得zui大的"補償",，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長！操作步驟：
a.平衡開始時將流速緩慢地提高,，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低,，則需要較長的時間來平衡）
b.如果使用的流動相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡,；分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子,。
2．色譜柱的再生
長期使用的色譜柱，往往柱效會下降（柱子的理論塔板數(shù)減低）,?？梢詫ιV柱進行再生，在有條件的實驗室應(yīng)使用一個廉價的泵進行柱子的再生,。
建議用來沖洗柱子的溶劑體積 色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積 125-4mm1.6ml30ml 250-4mm3.2ml60ml 250-10mm20ml400ml
選擇再生方法：
極性固定相（如Si,，NH2*，DIOL基色譜填料）的再生： 正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非極性固定相（如反相色譜填料RP－18,，RP－8,，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或異丙醇）→乙腈→水
注意：
a.在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由于NH2可能以銨根離子的形式存在,，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗,，然后再用水沖洗至堿溶液*流出。
b.0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱,，如果簡單的用有機溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì),，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
3.色譜柱的維護
a．使用預(yù)柱保護分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度）
b．大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5,，盡量不超過該色譜柱的pH范圍
c．避免流動相組成及極性的劇烈變化
d．流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理
e．如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相,，應(yīng)在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中
f．氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,，故使用時要注意,，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕
1 ,、色譜柱的使用說明：
( 1 ),、 色譜柱使用前注意事項：色譜柱的儲存液無特殊說明,，均為評價報告所示的流動相,。在使用前，一定要注意色譜柱的儲存液與要分析樣品的流動相是否互溶,。在反相色譜中,，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑,，應(yīng)先用 10 ％左右的低濃度的有機相洗脫劑過渡一下,，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機相中很容易析出，堵塞色譜柱,。
( 2 ),、 流動相：流動相中所使用的各種有機溶劑要盡可能使用色譜純，配流動相的水是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水,。如果將所配得流動相再經(jīng)過 0.45μm 的濾膜過濾一次則更好,，尤其是含鹽的流動相。另外,，裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過濾器等裝置應(yīng)該定期清洗或更換,。
以常規(guī)硅膠為基質(zhì)的鍵合相填料通常的 PH 值適用范圍是 2.0-8.0 ， BDS C18 適合于堿性化合物,， PH 值適用范圍為 2.0-10.0 ,。當必須要在 PH 值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時，每次使用結(jié)束后立即用適合于色譜柱儲存并與所使用的流動相互溶的溶劑清洗,，并*置換掉原來所使用的流動相,。
( 3 )、 樣品：樣品也要盡可能清潔,，可選用樣品過濾器或樣品預(yù)處理柱( SPE )對樣品進行預(yù)處理,；若樣品不便處理，要使用保護柱,。在用正相色譜法分析樣品時,，所有的溶劑和樣品應(yīng)嚴格脫水。
2 ,、色譜柱的保存
( 1 ),、 反相色譜柱每天實驗后的保養(yǎng)：使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應(yīng)用 10% 的甲醇 / 水沖洗 30 分鐘,，洗掉色譜柱中的鹽,，再用甲醇沖洗 30 分鐘。 注意：不能用純水沖洗柱子,，應(yīng)該在水中加入 10% 的甲醇,，防止將填料沖塌陷。
( 2 ),、 長期保存色譜柱：如色譜柱要長時間保存,，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中,，正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中,，離子交換柱可以儲存于水(含防腐劑*或柳硫汞)中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上,。儲存的溫度是室溫,。
3 ,、色譜柱的再生因為色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數(shù)的增加,，會出現(xiàn)色譜峰高降低,，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來說可能是柱效下降,。
( 1 ),、 反相柱的再生 ： 依次采用 20-30 倍的色譜柱體積的甲醇：水 =10 ： 90 ( V/V )，乙腈,，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱,。
( 2 ),、 正相柱的再生 ： 依次以 20-30 倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇,、二氯甲烷,、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱,。要注意上述溶劑必須嚴格脫水,。
4 、色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法色譜柱在使用中zui常見的問題就是柱壓升高,，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加,，屬于正常現(xiàn)象,。但柱壓在使用過程中突然升高(系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外),，可能的原因有如下幾點：
( 1 )、色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染,；
( 2 ),、色譜柱頭的填料被樣品污染；
( 3 ),、色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑,，形成結(jié)晶析出；
( 4 ),、流動相 PH 值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解,。
解決辦法如下：
( 1 )、如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染,，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力,，或者卸下色譜柱頭，將其放在 10 ％的稀硝酸內(nèi)超聲清洗 10 分鐘,，后再用純水超聲 10 分鐘,，重新裝入色譜柱,。
( 2 )、如確定色譜柱頭的填料被污染,，將柱頭螺絲卸下,，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入,，仔細修復(fù)后,，重新安裝上柱頭螺絲。
( 3 ),、如確定定是鹽結(jié)晶,，用 10% 的甲醇 / 水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解，再換高濃度甲醇,。
( 4 ),、如果因 PH 值使用不當，很難恢復(fù),。