液相色譜法的主要類型及其分離原理

　　根據(jù)分離機(jī)制的不同，液相色譜法可分為下述幾種主要類型：

　　1 .液 — 液分配色譜法（Liquid-liquid Partition Chromatography）及化學(xué)鍵合相色譜（Chemically Bonded Phase Chromatography）

　　流動(dòng)相和固定相都是液體,。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同,，避免固定液流失），有一個(gè)明顯的分界面,。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱,，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí),，服從于下式：

　　式中,，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度;cm--溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度; Vs—固定相的體積;Vm—流動(dòng)相的體積,。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K,，K大的組分保留值大;但也有不同之處,，GPC中，流動(dòng)相對(duì)K影響不大,，LLPC流動(dòng)相對(duì)K影響較大,。

　　a. 正相液 — 液分配色譜法（Normal Phase liquid Chromatography）: 流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。

　　b. 反相液 — 液分配色譜法（Reverse Phase liquid Chromatography）: 流動(dòng)相的極性大于固定液的極性,。

　　c. 液 — 液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求*不同,，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解;流動(dòng)相通過(guò) 拾步便民新昌色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失,。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相（見(jiàn)后）,，可克服上述缺點(diǎn)。現(xiàn)在應(yīng)用很廣泛（70~80%）,。

　　2 .液 — 固色譜法

　　流動(dòng)相為液體,，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）,。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來(lái)進(jìn)行分離的,。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時(shí)，溶質(zhì)分子 （X） 和溶劑分子（S）對(duì)吸附劑表面活性中心發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附（未進(jìn)樣時(shí),，所有的吸附劑活性中心吸附的是S）,，可表示如下：

　　Xm + nSa ====== Xa + nSm

　　式中：Xm--流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子;Sa--固定相中的溶劑分子;Xa--固定相中的溶質(zhì)分子;Sm--流動(dòng)相中的溶劑分子。

　　當(dāng)吸附競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)：

　　K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

　　式中：K為吸附平衡常數(shù),。[討論：K越大,，保留值越大。]

　　3 .離子交換色譜法（Ion-exchange Chromatography）

　　IEC是以離子交換劑作為固定相,。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換,，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。

　　以陰離子交換劑為例,，其交換過(guò)程可表示如下：

　　X-（溶劑中） + （樹脂-R4N+Cl-）=== （樹脂-R4N+ X-） + Cl- （溶劑中）

　　當(dāng)交換達(dá)平衡時(shí)：

　　KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

　　分配系數(shù)為：

　　DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]

　　[討論：DX與保留值的關(guān)系]

　　凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來(lái)進(jìn)行分離,。

　　4 .離子對(duì)色譜法（Ion Pair Chromatography）

　　離子對(duì)色譜法是將一種 （ 或多種 ） 與溶質(zhì)分子電荷相反的離子 （ 稱為對(duì)離子或反離子 ） 加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對(duì)化合物,，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為,。其原理可用下式表示：

　　X+水相 + Y-水相 === X+Y-有機(jī)相

　　式中：X+水相--流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子（也可是陽(yáng)離子）;Y-水相--流動(dòng)相中帶相反電荷的離子對(duì)（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基*銨等）;X+Y---形成的離子對(duì)化合物,。

　　當(dāng)達(dá)平衡時(shí)：

　　KXY = [X+Y-]有機(jī)相/[ X+]水相[Y-]水相

　　根據(jù)定義,，分配系數(shù)為：

　　DX= [X+Y-]有機(jī)相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相

　　[討論：DX與保留值的關(guān)系]

　　離子對(duì)色譜法（特別是反相）發(fā)解決了以往難以分離的混合物的分離問(wèn)題，諸如酸、堿和離子,、非離子混合物,，特別是一些生化試樣如核酸、核苷,、生物堿以及藥物等分離,。

　　5 .離子色譜法（Ion Chromatography）

　　用離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相,。以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器,，為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo)檢測(cè)器的干擾，設(shè)置了抑制柱,。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同,。

　　以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例,。當(dāng)待測(cè)陰離子Br-隨流動(dòng)相（NaOH）進(jìn)入色譜柱時(shí),，發(fā)生如下交換反應(yīng)（洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的逆過(guò)程）：

　　抑制柱上發(fā)生的反應(yīng)：

　　R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

　　R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

　　可見(jiàn)，通過(guò)抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水,，消除了本底電導(dǎo)的影響;試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸H+Br-,，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測(cè)。

　　離子色譜法是溶液中陰離子分析的*方法,。也可用于陽(yáng)離子分析,。

　　6 .空間排阻色譜法（Steric Exclusion Chromatography）

　　空間排阻色譜法以凝膠 （gel） 為固定相。它類似于分子篩的作用,，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多,，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來(lái)進(jìn)行分離,，而是按分子大小進(jìn)行分離,。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后,，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過(guò),。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過(guò)柱子,，首先在色譜圖上出現(xiàn),，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值z(mì)ui大,，在色譜圖上zui后出現(xiàn),。