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離心機(jī)離心分離的幾種方法及特點(diǎn)
閱讀：3785 發(fā)布時(shí)間：2017-11-17
制備型超高速離心機(jī)的幾種分離方法：
A.差速離心：逐次增加離心力,，每次可沉降樣品溶液中的一些組份,。
差速離心是一種zui常用的方法。在這種方法中,，離心管在開(kāi)始時(shí)裝滿了均一的樣品溶液,。通過(guò)在一定速度下一定時(shí)間的離心后,，就可得到兩個(gè)部份：沉淀和上清液。
通常在*次離心時(shí)把大部分不需要的大粒子沉降去掉,。這時(shí)所需的組份大部分仍留在上清液中,。然后將收集到的上清液以更高速度離心，把所需的粒子沉積下來(lái),。離心的時(shí)間要選擇得當(dāng),，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對(duì)于得到的沉淀和上清液可以進(jìn)行進(jìn)一步的離心,，直到達(dá)到所需要的分離純度為止,。
差速離心的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，但分離純度不高,。
B.密度梯度離心法：可以同時(shí)使樣品中幾個(gè)或全部組份分離，具有很好的分辨率,。
1)速率區(qū)帶法(rate zonal)：
根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S),。大致步驟如下：
在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度),。
將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部,。樣品在梯度溶液表面形成一負(fù)梯度。
由于不同大小的粒子在離心力作用下,，在梯度中移動(dòng)的速度不一樣,，所以經(jīng)過(guò)離心后會(huì)形成幾條分開(kāi)的樣品區(qū)帶。
注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點(diǎn)的密度,。離心過(guò)程必須在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止,。
2)等密度離心法(isopycnic)：
根據(jù)粒子的不同密度來(lái)分離。離心過(guò)程中,，粒子會(huì)移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶,。
密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中,。經(jīng)離心后,，樣品粒子達(dá)到它們的平衡點(diǎn)。
注意：平衡后粒子的分離*由其密度決定,，與時(shí)間無(wú)關(guān),，此時(shí)再改變離心轉(zhuǎn)速，只能改變區(qū)帶的相對(duì)位置,。
密度梯度分析法：
1)梯度介質(zhì)性質(zhì)與選擇：
A,、應(yīng)具備的性質(zhì) ：
梯度物質(zhì)的選擇原則是滿足分離方法的基本要求，一個(gè)理想的密度材料標(biāo)準(zhǔn)它應(yīng)是：
*所形成的溶液密度應(yīng)包括所需要的密度范圍,。
*具有某些性質(zhì),，如折射率,，據(jù)此可測(cè)定它的濃度。
*所形成的溶液粘度低,。
*不損傷所分離的樣品,。
*離心分離后容易除去。
*不妨礙分離積分的分析,。
2),、梯度形狀
梯度形狀分：線型、等速型,、階梯型,、平坦型、陡峭型指數(shù)梯度,。
梯度形狀對(duì)于分離是否成功非常重要：
zui常用的是線型梯度,，適用于分離蛋白質(zhì)、酶,、激素,、核糖體亞基和一些植物病毒；等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品,；不連續(xù)或階梯型梯度zui適用于分離整細(xì)胞,、亞細(xì)胞組分以及純化一些哺乳類動(dòng)物病毒或昆蟲(chóng)病毒。等速梯度以及長(zhǎng)液柱可增進(jìn)分離能力,，適用于分離核糖體亞基,、多核糖體及植物病毒。
B.梯度柱制備：
梯度液柱可以用手工或梯度儀制備
半注法：
為縮減離心時(shí)間,，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質(zhì),，中間加樣品，上面鋪Buffer或液體石臘油,。
3),、加樣方法與加樣量：
將樣品加到梯度液柱上，針尖和離心管成45-60°角度,，慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去,，對(duì)于DNA一類易斷的脆弱樣品，應(yīng)該用孔徑較大的移液管代替針頭,，以避免剪切力對(duì)樣品的切割作用,。樣品濃度是梯度柱zui小密度的1/10(W/W)。
4),、轉(zhuǎn)子的選擇與效應(yīng)：
5),、分離區(qū)帶的回收及檢測(cè)
離心后所形成的區(qū)帶樣品的回收方法基本有四種：
a.穿刺法
穿刺離心管底部，使梯度溶液滴出,，將一具有合適閥門(mén)的蓋帽放在離心管頂,，可控制滴出速度,。
b.虹吸法：
將一毛細(xì)管輕輕插入管底，盡量防止梯度抖動(dòng),，用微量泵逐漸滴取,，以一定量滴數(shù)或體積部分收取。
c.加壓法：
通過(guò)一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部,，部分收集換出的溶液,。
d.切割法：
采用的切割刀切割所需區(qū)帶。
區(qū)帶檢測(cè)：
所謂區(qū)帶檢測(cè),，實(shí)際上是對(duì)水平轉(zhuǎn)子或角轉(zhuǎn)子和垂直轉(zhuǎn)子離心管中的分離物質(zhì)所做的監(jiān)測(cè),，通常只是測(cè)量在260或280mm時(shí)長(zhǎng)的吸收值，以決定梯度中的核酸或蛋白的整個(gè)分布,，這個(gè)操作通常稱之為在線(on line)監(jiān)測(cè),。