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稱取同一試樣兩份于 A,、B 管中,，加入氘代氯丙醇酯同位素內(nèi)標(biāo)，用氫氧化鈉-甲醇溶液進(jìn)行酯鍵斷裂反應(yīng),，3 -氯- 1, 2-丙二醇酯（3-MCPDE）,、2-氯-1, 3-丙二醇酯（2-MCPDE）和縮水甘油酯（GE）分別轉(zhuǎn)化為游離態(tài) 3-MCPD、2-MCPD,、縮水甘油,；試液經(jīng)中和、凈化和苯基硼酸衍生后,，以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測,。

B 管樣品加入酸化溴化鈉溶液中和后，GE 水解生成的縮水甘油轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）,，不影響氯丙醇酯的計(jì)算,，B管用以測定試樣中 3-MCPDE、2-MCPDE 的含量,；A 管樣品經(jīng)酸化氯化鈉溶液中和后,，GE 水解后生成的縮水甘油主要轉(zhuǎn)化為 3-MCPD，測定得到的 3-MCPDE 值為試樣中 3-MCPDE 和縮水甘油酯（GE）之和,，由 A 管和B 管 3-MCPDE 含量的差值,，再乘以 3-MCPDE和GE 的折算系數(shù)，得到試樣中 GE 的含量,。

實(shí)驗(yàn)用到的標(biāo)準(zhǔn)品信息見下表：

表1 標(biāo)準(zhǔn)品信息

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置

氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）：分別準(zhǔn)確移取1 mL 100 μg/mL 3-MCPDE、2-MCPDE標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中,，用甲苯定容至刻度,。于-20 ℃保存,，保存期 6個(gè)月。

氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL I（2 μg/mL）：準(zhǔn)確移取1 mL 10 μg/mL 氯丙醇酯混標(biāo)中間液,，用甲苯定容至5 mL,。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月,。

氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL II（0.2 μg/mL）：準(zhǔn)確移取1 mL 2 μg/mL 氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液I,，用甲苯定容至10 mL。臨用現(xiàn)配,。

縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）：準(zhǔn)確移取1 mL 100 μg/mL 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中,，用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存,，保存期 6個(gè)月,。

縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL I（2 μg/mL）：準(zhǔn)確移取1 mL 10 μg/mL 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲苯定容至5 mL,。于-20 ℃保存,，保存期 3個(gè)月。

縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL II（0.2 μg/mL）：準(zhǔn)確移取1 mL 2 μg/mL 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)工作液I,，用甲苯定容至10 mL,。臨用現(xiàn)配。

內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（D5-3-MCPDE:1µg/mL,，D5-2-MCPDE:1µg/mL）：分別準(zhǔn)確移取0.2 mL 50 μg/mL D5-3-MCPDE和D5-2-MCPDE標(biāo)準(zhǔn)溶液到10 mL容量瓶中,，用甲苯稀釋至刻度。于-20 ℃保存,，保存期 3個(gè)月,。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

按照下表所示，分別配制氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)曲線和縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)曲線,。加入甲苯,、叔丁基甲醚（tBME）、內(nèi)標(biāo)工作溶液和相應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,，按照“樣品前處理"進(jìn)行操作,，上機(jī)檢測得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

（B管,，加入酸性溴化鈉）

表3 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

（A管,，加入酸性氯化鈉）

標(biāo)準(zhǔn)品配制注意事項(xiàng)：

1、氯丙醇酯濃度均以對應(yīng)的氯丙醇計(jì),，縮水甘油酯濃度以縮水甘油計(jì),，定量計(jì)算中需特別注意。

2、如使用純品型標(biāo)品,，需注意計(jì)算標(biāo)品的純度和對應(yīng)的折算系數(shù),。建議選擇安譜璀世溶液型標(biāo)品，進(jìn)行稀釋配制,，操作更加方便,。

3、注意區(qū)分AB管,，氯丙醇酯標(biāo)曲加入溴化鈉溶液,，縮水甘油酯標(biāo)曲加入氯化鈉溶液；內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均需要加入,。

試劑配置：

硫酸水溶液（25%）：將25 mL硫酸轉(zhuǎn)移至含有50 mL純水的100 mL容量瓶中。用純水稀釋至刻度線并混勻,。

酸性溴化鈉水溶液（600 g/L）：稱取 60 g溴化鈉,，加水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,，加入3.5 mL 25%硫酸溶液,，用水定容至刻度，混勻,。

酸化氯化鈉水溶液（200 g/L）：稱取 20 g 氯化鈉,，加水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入3.5 mL 25%硫酸溶液,，用水定容至刻度,，混勻。

氫氧化鈉-甲醇溶液（0.35 mol/L）：稱取1.4 g氫氧化鈉,，加入甲醇溶解,，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度,，混勻,，轉(zhuǎn)移至塑料瓶中，儲(chǔ)存于10℃下,。臨用現(xiàn)配,。

苯硼酸溶液：稱取適量苯基硼酸，溶于無水乙_醚,，配制成飽和溶液,，混勻。

乙_醚-石油醚溶液（1+1）：量取乙_醚和石油醚各 100 mL,，混勻,。

乙_醚-乙酸乙酯溶液（6+4）：量取 60 mL 乙_醚和 40 mL 乙酸乙酯，混勻。

1%乙二醇溶液：移取 100 µL乙二醇,，加乙酸乙酯定容至 10 mL,，混勻。

試樣提?。?/strong>

準(zhǔn)確稱取兩份嬰幼兒配方奶粉試樣0.5 g（精確至 1 mg）于兩支40 mL玻璃螺紋樣品瓶中（A,、B管），分別準(zhǔn)確加入100 µL混合內(nèi)標(biāo)工作液（1 µg/mL）,；加入2 mL 65 ℃±5 ℃水,，渦旋混勻，再加入1 mL氨水,，蓋塞渦旋混勻,，在65℃±5℃水浴下振蕩30 min，取出后冷卻至室溫,。加入3 mL乙醇,，渦旋后加入5 mL乙_醚，振搖5 min,，然后加入5 mL石油醚,，繼續(xù)振搖5 min。待溶液靜置分層后,，取上層溶液于40 mL玻璃樣品瓶中,；再加入乙_醚和石油醚各5 mL，重復(fù)萃取1次,，合并有機(jī)相于40 ℃下氮吹濃縮至干,，用2 mL乙_醚-石油醚溶液（1+1）淋洗樣品瓶內(nèi)壁，將洗液轉(zhuǎn)移至8 mL玻璃螺紋樣品瓶中,，于40 ℃下氮吹至干,，供堿水解。

堿水解（酯鍵斷裂反應(yīng)）：

向提取脂肪樣品中加入100 µL甲苯,、200 µL叔丁基甲醚（tBME）,。渦旋混勻30 s，10°C水浴冷卻7 min,。加入200 µL于10℃±1℃下冷卻好的 0.35 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液,，渦旋混勻，于10℃±1℃下水解反應(yīng)7 min,。結(jié)束后立即于A管,、B管中分別加入酸化氯化鈉溶液、酸化溴化鈉溶液各600 µL終止水解反應(yīng),，渦旋,，放置5 min,。

于上述A、B管中和后的水解液中各加入600 µL正己烷,，渦旋30 s后,，靜置待分層后棄去正己烷液，再加入正己烷重復(fù)萃取一次,。若分層不理想,，可以2000 r/min的速度離心3 min，下層水相供衍生用,。

試樣凈化：

在凈化的水溶液中加入0.5 mL無水乙_醚-乙酸乙酯（6+4）,，渦旋10 s，取上層溶液于裝有約0.3 g無水硫酸鈉的離心管中,，渦旋,，再加入0.5 mL無水乙_醚-乙酸乙酯（6+4）重復(fù)萃取操作。

衍生化反應(yīng)：

合并2次萃取液,，向凈化液中加入30 µL苯基硼酸溶液,，渦旋30 s后，加入30 µL 1%乙二醇溶液,，渦旋,，靜置分層，必要時(shí)可離心使分層徹_底,，將溶液轉(zhuǎn)移至裝有約0.3 g無水硫酸鈉的玻璃樣品瓶中,，渦旋混勻10 s,，提取液過0.22 μm的疏水性PTFE針式濾器后供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定,。

前處理注意事項(xiàng)：

1、0.35 mol/L甲醇鈉溶液建議存放在4℃條件下,，建議至少存放2h以上,，臨用前拿出；

2,、10°C低溫酯交換反應(yīng)時(shí)需盡量將整個(gè)螺紋瓶浸泡在水中,，以保證螺紋瓶內(nèi)溫度穩(wěn)定；

3,、前處理過程中盡量避免使用塑料耗材,，可使用玻璃螺紋瓶、玻璃巴斯德吸管,、玻璃移液管,、手動(dòng)進(jìn)樣針等耗材，建議進(jìn)行方法空白實(shí)驗(yàn)監(jiān)控過程本底情況,；

4,、建議使用疏水性PTFE針式濾器進(jìn)行過濾；

5、注意區(qū)分AB管,，B管加入溴化鈉溶液用于檢測3-MCPDE和2-MCPDE的含量,，A管加入氯化鈉溶液用于校正計(jì)算GE的含量。

儀器維護(hù)注意事項(xiàng)：

1、隨著進(jìn)樣次數(shù)的增加,，儀器輕微污染,，目標(biāo)物保留時(shí)間可能發(fā)生偏移；

2,、該實(shí)驗(yàn)對儀器污染比較嚴(yán)重,，儀器受到嚴(yán)重污染后，可能導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)降低,、分離度變差等情況,，需注意儀器的清洗維護(hù)，包括進(jìn)樣針的清洗,，離子源的清洗,，色譜柱的老化等；

3,、如儀器配制程序升溫進(jìn)樣口和反沖功能,，可明顯降低對儀器的污染程度。

4,、建議色譜柱加裝2m 相同固定相的預(yù)柱,，定期對預(yù)柱進(jìn)行更換，可延長色譜柱的使用壽命,。

6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

在加入酸性溴化鈉溶液的B管標(biāo)準(zhǔn)樣品中,，以氯丙醇酯的質(zhì)量(以醇計(jì))為橫坐標(biāo),，以氯丙醇酯與其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在加入酸性氯化鈉溶液的A管標(biāo)準(zhǔn)樣品中,，計(jì)算 3-MCPD 與內(nèi)標(biāo) D5-3-MCPD 的峰面積比值,，通過 3-MCPD 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（B管標(biāo)準(zhǔn)樣品得到）計(jì)算得到A管標(biāo)液中 3-MCPD（由縮水甘油酯標(biāo)品轉(zhuǎn)變而來）的質(zhì)量。以 GE 的質(zhì)量（以縮水甘油計(jì)）為橫坐標(biāo),，GE 轉(zhuǎn)化后形成的 3-MCPD的質(zhì)量為縱坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)（1/a）即為 3-MCPD 增加量折算成 GE 含量的系數(shù)t,。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

6.2 加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

本次實(shí)驗(yàn)方法空白未檢出氯丙醇酯和縮水甘油酯,，奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的本底含量分別為0.040,、0.024,、0.006 mg/kg。

奶粉樣品中3-氯丙醇酯,、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)見下表,。

表6 奶粉基質(zhì)的加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)（n=3）

數(shù)據(jù)計(jì)算注意事項(xiàng)：

1、本實(shí)驗(yàn)3-氯丙醇酯使用D5-3 -氯- 1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯作為定量內(nèi)標(biāo),；2-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯作為定量內(nèi)標(biāo)；

2,、縮水甘油酯最終含量以縮水甘油計(jì),，因此其含量不是簡單的A、B管的3-MCPD差值,，需要乘以折算系數(shù),；

3、基質(zhì)樣品通常含有本底,，回收率均為扣除本底后計(jì)算得到,。

使用安譜實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)耗材,，參照國標(biāo)《GB 5009.191-2024 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測定》第二篇第三法,，堿水解方法,，使用氘代同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，AB雙樣校準(zhǔn)縮水甘油酯含量,，3-氯丙醇酯,、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率在85%-110%之間,，RSD小于10%,。該方法操作簡便快速,，能夠很好的滿足奶粉基質(zhì)中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測,。