不僅僅要知道怎么做,，還必須知道為什么這么做，透過現(xiàn)象看本質(zhì),，透過原理,，來解答SPE小柱操作的常見疑惑，今天小編就透過SPE背后的原理,，告訴您SPE為什么有這樣哪樣的操作要求,，一起來圍觀吧！
01
為什么SPE小柱操作要強調(diào)流速,？
答：SPE小柱的填料裝填壓實以后,，形成柱床，當溶劑流過小柱,，速度過快將導致兩個問題,，一個問題是對于鍵合相填料，由于流速快而使得其不能充分浸潤舒展,，因而導致其保留活性降低,；其次過快的流速導致小柱可能形成溝渠，使得填料未被充分浸潤,，降低了吸附填料與樣品的接觸面積,，影響了目標物質(zhì)的傳質(zhì)過程，因而導致回收率降低,。對于0.5-3.0mL/min的小柱流速通常是不會產(chǎn)生溝渠效應的,，另外溝渠的形成與柱床高度有關，對于薄膜型的萃取膜片或者膜盤,，由于橫截面大,，柱床低，在高流速下不會導致嚴重的溝渠效應,，因此適合在高流速的大體積水樣的富集,，對于離子交換和特異性吸附，填料和分析目標物的相互作用時間比常規(guī)小柱長,，流速的控制，確保了好的保留效果,。
溝渠效應
SPE小柱的填料裝實后,，當通過小柱的流速較低時，液體是以層流的方式通過填料層,，將填料層浸潤充分,，濕潤的液面截層逐級向前推進，見附圖；當流速過大的時候,，而柱床厚度較高時,，可能會在填料內(nèi)部形成溝渠通道，液流將通過溝渠,，快速通過小柱,，而使得填料的浸潤變得不充分，這樣將使得體與填料的接觸面積大大降低,，嚴重影響填料對目標物質(zhì)的保留效果,。
圖一、SPE形成溝渠和田間灌溉的溝渠
圖二,、SPE正常層流和溝流通過小柱填料
02
溶劑環(huán)境的pH怎么影響化合物在小柱上的保留,，為什么我們要關注化合物的pKa值，在C18小柱中需要考慮這些因素嗎,？
答：首先我們來說一下,，Ka指的是酸度系數(shù)，又名酸離解常數(shù),，可以理解為酸離解H離子的能力,，而pKa=-lgKa，對于酸,，在環(huán)境pH下存在如下平衡：
左邊的A-/HA,，實際是指溶劑環(huán)境下，離子態(tài)和分子態(tài)的比例,，右邊反映了左側(cè)兩者的轉(zhuǎn)化關系,，取決于（pH-pKa)的數(shù)值大小。對于離子交換小柱,，保持目標物的離子化而非分子態(tài),，是一個關鍵點，這對于離子交換作用機理的交換柱,，將直接關系到其實驗成敗,。而對于硅膠鍵合C18小柱的萃取，由于硅膠（—SiOH）不能*“封端”,，在pH大于4.0的情況下,，硅膠都會帶上負電荷，因而會使得能電離的化合物與硅膠作用,，增強了這種附帶的次級作用理（主作用力為非極性相互作用力）,，而使得此類物質(zhì)在硅膠-C18上的保留增強，若只考慮C18的非極性作用力,，必然會導致回收結果的不盡人意,。
03
中性氧化鋁，酸性氧化鋁、堿性氧化鋁,，怎么區(qū)分,？
答：Al2O3 的主要作用力是通過金屬鋁中心與化合物的羥基形成氫鍵來吸附，或者通過離子交換作用,。中性氧化鋁（Al-N）：pH為6.5,，中性氧化鋁主要通過鋁原子中心與帶有高負電荷的雜原子作用，如：N,、O,、P、S及富電子的芳香族化合物,。
先理解酸化后和堿化后的氧化鋁,，氧化鋁的性能變化：
Al2O3 + 6HCl = 2AlCl3 + 3H2O；
Al2O3 + 2NaOH= 2NaAlO2(偏鋁酸鈉) + H2O
酸化的氧化鋁和堿化的氧化鋁,，使得氧化鋁表面的電荷性發(fā)生改變,，如酸性氧化鋁帶正電荷的中心容易吸附陰離子，并且產(chǎn)生偶極作用,，吸附極性化合物,；而堿性則吸附極性和含陽離子官能的化合物。
04
為什么在農(nóng)殘檢測過程中GCB常見于凈化模式,，而不用于富集模式,？
答：SPE的凈化模式常被用來吸附雜質(zhì)，而富集模式常被用來吸附目標物質(zhì),，GCB是一種石墨化碳黑,，是將炭黑在惰性氣氛下加熱到2700-3000℃烘焙而成，它由六個碳原子構成平面六角形,，并且層疊而成,，對于芳香平面分子，很容易嵌入,，而具有較強吸附芳香化合物的選擇性,，對于其他分析物也有較好的吸附性能，填料的吸附與解吸附的性能將直接影響填料的使用范圍,，對于GCB而言,，其吸附性能較強，但是解吸附的可逆性稍差,，需要選擇合適強度的溶劑來釋放被吸附的物質(zhì),，因而造成了解析溶劑匹配較為困難，由于其對色素等的優(yōu)xiu吸附性能,，因而在農(nóng)殘樣品處理中，常用來吸附色素等雜質(zhì)，而不是選擇用來保留目標化合物,。
05
HLB小柱為什么與傳統(tǒng)的硅膠鍵合C18不一樣,，廠商建議可以不活化平衡？
答：SPE小柱活化平衡的目的有兩個,，一是使得鍵合官能團填料的濕潤和舒展,，使之保持對目標化合物的大吸附活性，另外一個目的就是去除填料本身可能引入的雜質(zhì),。我們知道硅膠鍵合C18,，是在硅膠微球表面鍵合疏水性的C18官能團，為了使得其保持對目標物的充分的吸附活性,，需要在濕潤的環(huán)境上樣,，在填料表層形成的液膜（活化平衡）和上樣的溶劑分子有良好的相容性，目標物在膜間進行傳質(zhì),，與鍵合C18發(fā)生疏水作用而保留,，C18本身不具備水浸潤性，直接上水樣,，C18蜷縮,，而且強的疏水性導致其與溶劑中的目標物質(zhì)接觸傳質(zhì)變得困難，因此活化平衡*,，HLB小柱采用聚合物改性材料,，增加了親水基團，使得在上樣溶劑時就能很好的和水溶劑互溶,，因而填料的官能團能在上樣溶劑的環(huán)境下就與目標物分子充分接觸,，而發(fā)生傳質(zhì)，使得目標物質(zhì)被充分保留住,。
06
淋洗步驟通常需要干燥,，這個原因是什么？
答：淋洗液通常要干燥,，主要作以下考量：
1.通常由于反相萃取在化合物的前處理中使用的比較多,，正如反相色譜在色譜中作為常見的分離方法一樣，在反相萃取中的淋洗液常為水相或者含水的緩沖溶液,，去除水份,，可以便于后續(xù)干燥濃縮步驟。
2.有的項目,，在淋洗步驟完成后,，直接用一定體積的洗脫液，比如1ml的甲醇洗脫,，此過程將洗脫與定容集為一步處理,，前一步的處理必然對洗脫步驟的定量結果產(chǎn)生影響,。
3.便是溶劑互溶問題，當淋洗步驟使用的溶劑極性與洗脫溶劑的極性差異較大時,，會產(chǎn)生乳化分層,，洗脫阻力大，洗脫液被稀釋的風險等,，導致洗脫效果的差異,，以致于實驗結果的失敗。
07
我們在使用硅膠鍵合填料類型的色譜柱的時候,，出于對色譜學的常識,，知道了硅膠鍵合填料一般廠商建議的pH使用范圍為2-8，那么對于使用硅膠鍵合的填料的固相萃取小柱,，是否需要嚴格遵守這樣一條規(guī)定,？
答：首先，我們需要了解到,，廠家建議的pH2-8的耐受范圍,，是為了保證色譜柱的正常使用壽命，硅膠鍵合相在超出耐受的pH范圍使用,，會導致鍵合相與硅膠基質(zhì)的斷裂,，因此會損害色譜柱柱效和保留特性，但是我們知道這個pH耐受值范圍外的溶劑對于色譜柱的影響,，主要是一個積累性的過程,，在溶劑沖刷下，逐漸溶解而導致色譜柱性能改變和不可逆,，壽命減短,。SPE小柱和色譜柱的一個差異就是，SPE是一次性消耗品,，在耐受的溶劑范圍外,，短暫時間的溶劑沖刷對于小柱的保留特性影響甚微，并不會導致其保留顯著差異,，因此其使用的pH范圍更寬,，一般可以在pH值范圍1-10使用，而不會導致其結果的差異性,。
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