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超微量紫外可見分光光度計(jì)是通過檢測物質(zhì)波長處或某一波長范疇內(nèi)光的吸收度,,對物質(zhì)進(jìn)行定量與定量分析的儀器設(shè)備,,目前已成為現(xiàn)代分子生物學(xué),、藥物學(xué),、食品科學(xué)等領(lǐng)域的常用儀器,。常用于核酸,,蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。
1,、核酸的定量
核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率的功能,。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,,單鏈,、雙鏈DNA,以及RNA,。核酸的吸收峰的吸收波長260nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸,,事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,,從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。
2,、核酸的純度檢測
除了核酸濃度,超微量分光光度計(jì)同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,,如:
(1)A260/A280的比值,,用于評估樣品的純度,因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm,。純凈的樣品,,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響,。
(2)A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,,多肽,苯酚等,,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。
3、蛋白質(zhì)直接定量
這種方法是在280nm波長,,直接測試蛋白,。超微量分光光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),一般要消除320nm的"背景"信息,,設(shè)定此功能"開",。與測試核酸類似,要求A280的吸光值大于0.1A,,的線性范圍在1.0-1.5之間,。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測試較純凈,、成分相對單一的蛋白質(zhì),。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,,操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高,。
4,、比色法蛋白質(zhì)定量(顏色反應(yīng))
蛋白質(zhì)比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì),。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),,從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。
比色方法一般有BCA,Bradford,,Lowry等幾種方法,。
由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性,。所以在選擇比色法之前,,是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,。
5,、OD600(菌落密度)
實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長期,多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測推斷細(xì)菌的生長密度,。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn),,需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。通過檢測600nm處細(xì)胞生長培養(yǎng)的吸光度,,從而監(jiān)測微生物或其他細(xì)胞培養(yǎng)的生長率,。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。實(shí)驗(yàn)中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值,,原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,,即細(xì)菌培養(yǎng)一段時間后,與培養(yǎng)基反應(yīng),,發(fā)生變色反應(yīng),。
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