組織切片伴隨著顯微鏡技術(shù)和免疫實驗等的發(fā)展而得到廣泛的應(yīng)用。對本文其中的冰凍切片,、石蠟切片,、碳蠟切片、超薄切片,、塑料切片等幾種常用的實驗方法相關(guān)操作步驟進(jìn)行介紹,。

冰凍切片

是免疫組織化學(xué)染色中的一種切片方法,。其優(yōu)點是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng) 采用冰凍切片,。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片,。

冰凍時，組織中水份易形成冰晶,，往往影響抗原定位,。一般認(rèn)為冰晶少而大時，影響較小,，冰晶小而多時,，對組織結(jié)構(gòu)損害較大，在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生,。冰晶的大小與其生長速率成正比,，而與成核率(形成速率)成反比，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小,，對組織結(jié)構(gòu)影響愈嚴(yán)重,。因此，應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)量,。Fish認(rèn)為冰凍開始時,，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加,，其臨界溫度為-33,。C, 從-30。C降至-43,。C之間,，成核率急劇增加達(dá)1018，然后再減慢,?；谏鲜隼碚摽刹扇∫韵麓胧p少冰晶的形成。

(1)速凍,，使組織溫度驟降,，縮短從-33。C43,。C的時間,，減少冰晶的形成。其方法有二：

①干冰-丙酮(酒精)法：將150-200ml丙酮(酒精)裝入小保溫杯內(nèi),，逐漸加入干冰,，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時，溫度可達(dá)-70℃C,，用一小燒杯(50-100ml)內(nèi)裝異戊烷約50ml,，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮(純酒精)飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達(dá)-70℃時即可使用,。將組織(大小為1cm×0.8cm×0.5cm)投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出,，或置恒冷箱內(nèi)以備切片,，或置-80℃低溫冰箱內(nèi)貯存,。

②液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)(直徑約2cm)，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織,，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi),，當(dāng)盒底部接觸液氮時 即開始?xì)饣序v，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中,，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊,。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆茫蛑萌牒憷湎淝衅瑱C冰凍切片,。

(2)將組織置于20%-30%蔗糖溶液1～3天,，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量,。

影響冰凍切片的因素較多,，因此，技術(shù)難度較大,，選擇好的冰凍切片機是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵,。目前冰凍切片機有兩類：

①恒慢冰凍切片機(Cryastat)：為較理想的冰凍切片機，型號很多,，但其基本結(jié)構(gòu)是將切片機置于-30℃C低溫密閉室內(nèi),，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至2-4μm,，*能滿足免疫組織化學(xué)標(biāo)記要求,。切片時，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～18℃為宜,，溫度過低組織易破碎,，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片,，切勿上下移動,。

②開放式冰凍切片機：包括半導(dǎo)體致冷切片機和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機,。切片時暴露空氣中,，溫度不易控制，切片技術(shù)難度 大，在高溫季節(jié) ,，切片更加困難,，且切片厚8～15μm，不易連續(xù)切片,，但其優(yōu)點是價廉,，國內(nèi)有生產(chǎn)。

冰凍切片后如不染色,，必須吹干,，貯存低溫冰箱內(nèi)， 或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存冰箱保存

石蠟切片

其優(yōu)點是組織結(jié)構(gòu)保存良好,，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值,，能切連續(xù)薄片，組織結(jié)構(gòu)清晰,，抗原定位準(zhǔn)確,。用于免疫組化技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同：①脫水、透明等過程應(yīng)在4℃,。C下進(jìn)行,，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應(yīng)限于2cm×1.5cm×0.2cm,，使組織充分脫水,、透明、浸蠟,。③浸蠟,、包埋過程中，石蠟應(yīng)保持在60℃以下,，以溶點低的軟蠟最好(即低溫石蠟包埋),。

以上全過程為18-24h，也可在室溫內(nèi)使用自動脫水機代替,。如組織塊小,，直徑小于0.5cm，可用快速石蠟包埋切片,，全過程只需4h左右,。

石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片機多為輪轉(zhuǎn)式,，切片厚度2～7μm,，應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性,，染色均勻一致,。由于甲醛固定、有機熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變,。有人報告經(jīng)蛋白酶消化,，可以改善光鏡免疫組化染色強度，常用的有胰蛋白酶,、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法,。石蠟切片應(yīng)入37℃恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象,。切片如需長期貯存,，可存放于4℃冰箱內(nèi)備用。

石蠟切片優(yōu)點較多,，但在制片過程中要經(jīng)過酒精,、二甲苯等有機溶劑處理,，組織內(nèi)抗原活性失去較多,，有人采用冷凍干燥包埋法(Freeze drying embedding methed)，可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì),，防止蛋白變性和酶的失活,，從而減少了抗原的丟失。該法是將新鮮組織低溫速凍,，利用冷凍干燥機(Freezing dryer)在真空,、低溫條件下排除組織內(nèi)水分 ，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織,，最后將組織浸蠟,、包埋、切片,。此法可用于免疫熒光標(biāo)記,、免疫酶標(biāo)記及放射自顯影。

振動切片

用振動切片機(Vibratotme),，可以把新鮮組織(不固定不冰凍)切成厚片20～100μm,，以漂浮法在反應(yīng)板進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應(yīng)陽性部位,，修整組織進(jìn)行后固定,，最后按電鏡樣品制備、脫水,、包埋,、超薄切片、染色觀察等,。組織不冰凍,，無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明,、包埋等步驟對抗原的損害,，能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原，主要用于顯示神經(jīng)系統(tǒng)抗原分布研究,。這種包埋前染色,，尤其實用于免疫電鏡觀察。

塑料切片

塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類(Glycol methacrylate, GMA)及環(huán)氧樹脂類(Epon 812,618),，其優(yōu)點是可以同時作光鏡和電鏡檢測,，能相互對照所查抗原，定位準(zhǔn)確,。塑料包埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片,，光鏡切片可薄至0.5～2um，故稱半薄切片(Semithin section),。GMA保存抗原較好,，不與組織產(chǎn)生共聚合，但形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)欠佳,。環(huán)氧樹脂如Fpon和Araldite能較好地保存形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu),，但在聚合過程中易和組織起作用，改變抗原結(jié)構(gòu),。塑料包埋切片由于處理程序繁多,，抗原活性易丟失。同時半薄切片進(jìn)行免疫染色時,，抗血清不易穿透樹脂,，因此，塑料切片主要用于免疫電鏡的超微切片前定位,。包埋前染色的標(biāo)本,，切片薄切片后不需染色，直接在相差顯微鏡下觀察免疫反應(yīng)部位呈黑點狀,，定位后進(jìn)一步作超薄切片,，這樣，可以明顯提高免疫電鏡陽性檢出率,。

超薄切片

電鏡標(biāo)本制作,，應(yīng)用超薄切片機(Ultrotome)進(jìn)行切片。

碳蠟切片

碳蠟(Carbowax),，學(xué)名聚乙烯二醇(Polyethlene glycol, PEG)為水溶性蠟,。根據(jù)其分子量不同，碳蠟有多種,，如400,、800,、1000、1500,、4000,、6000等，用于組織包埋的有1500,、4000兩種,，其熔點分別38℃C和52。C左右,，常溫下為固體石蠟狀,，加溫熔化呈液體狀。

本法的特點是組織固定水洗后,，不需脫水透明可直接浸蠟包埋,，且切片方法與常規(guī)石蠟切片相同。切下的組織片漂浮水面后自然展開,，碳虹迅速深化,，組織片即可展平，制片過程簡單易行,。

具體操作簡述如下：組織塊不宜過大,，一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以內(nèi)。①組織固定后充分水洗去除固定液,，用濾紙吸干組織表面水。②將組織浸入碳蠟(1500)內(nèi),，45℃30min,。③再次浸入混合混合碳蠟液(1500和4000等量混合液)，52℃ 30min,。④浸入等量混合碳蠟液(或根據(jù)氣溫,、濕度變化調(diào)整4000和5000混合比例，如氣溫高濕度大可以4000：1500=3：2混合,，反之,，則2：3混合)。⑤用等量混合碳蠟或調(diào)整混合碳蠟包埋成組織蠟塊,。⑥切片與石蠟切片相同,。在操作過程中，碳蠟組織塊應(yīng)盡量避免與水或冰接觸,，貯存時應(yīng)密封干燥冷藏,。

本法優(yōu)點是操作程序減少，時間縮短,，組織不經(jīng)有機溶劑損害,、溫度低,、抗原性保存比石蠟切片好，組織結(jié)構(gòu)清晰,。缺點是夏季室溫高時切片較困難,，連續(xù)切片不如石蠟切片順利;由于碳蠟有強吸濕性，不易保存時間較長,。