蛋白質(zhì)是與生命及各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)，機(jī)體中的每一個細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)的參與,。蛋白質(zhì)是由不同氨基酸以肽鍵相連所組成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子物質(zhì),，其結(jié)構(gòu)可分為以下4個結(jié)構(gòu)層次：

圖1 蛋白質(zhì)的四個結(jié)構(gòu)層次

我們所關(guān)注的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)指的是蛋白質(zhì)分子局部區(qū)域內(nèi)，多肽鏈沿一定方向盤繞和折疊的方式,，主要是分子內(nèi)的氫鍵維系的局部空間排列,，包括α螺旋、β折疊,、轉(zhuǎn)角,、無規(guī)卷曲等。

常見的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析的方法有四種：紅外光譜法、X射線衍射法,、圓二色譜法和熒光光譜法,，其中紅外光譜法的優(yōu)勢非常明顯，可以宏觀整體的鑒定復(fù)雜體系,，測定不同狀態(tài),、不同濃度和不同環(huán)境中的蛋白質(zhì)和多肽，而且紅外光譜法是一種快速的無損檢測方法,。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）法應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的定性和定量分析已有幾十年的歷史,，是一種非常成熟的檢測方法，人們對各類蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)紅外吸收峰,，以及同類蛋白質(zhì)不同組分的特種頻率和指認(rèn),，都已非常明確，如下表所示,。目前,，蛋白質(zhì)紅外檢測方法已廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、產(chǎn)品質(zhì)量控制和出廠檢測中,。

表1 各類蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)紅外吸收峰

根據(jù)樣品的形態(tài)不同,，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的紅外測試方法分為兩種：

1、液體樣品

常用配置為紅外光譜儀主機(jī)配套液體池附件和專門的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析軟件,，還可以根據(jù)測試需要增加溫度控制系統(tǒng),，如下圖所示。

圖2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)檢測

紅外液體池及溫控裝置

2,、固體樣品

常用配置為紅外光譜儀主機(jī)配套壓片機(jī),、衰減全反射（ATR）附件和測試軟件，含分峰,、差減,、求導(dǎo)、卷積,、去卷積,、曲線擬合等功能，或可根據(jù)測試需要配套帶溫控功能的ATR附件,。

FTIR用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析實(shí)例已經(jīng)非常多,，不僅可以對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性定量分析，如注射用人免疫球蛋白的檢測,，也可以對由溫度,、化學(xué)、物理和癌變等因素導(dǎo)致的變性蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,，下面力晶小天為大家舉幾個“栗子”：

人工抗原的鑒定

衰減全反射紅外光譜法可以實(shí)現(xiàn)原位測定和實(shí)時跟蹤,，對于需要觀察過程反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)具有很高的利用價值。通過對蛋白質(zhì)酰胺吸收帶的二階求導(dǎo)和去卷積等，可以觀察蛋白質(zhì)分子部分或全部去折疊引起的二級機(jī)構(gòu)的破壞以及相對含量的變化,。對此,，浙江農(nóng)林大學(xué)化學(xué)系的郭明等人合成致癌物氨基甲酸乙酯的人工抗原后，通過衰減全反射紅外光譜成功地對人工抗原蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及其含量進(jìn)行了分析,。利用FTIR對人工抗原化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定的應(yīng)用很多,，方法也非常成熟，除了ATR法,，液體池法和壓片法也經(jīng)常被采用,。

過敏原原肌球蛋白檢測

水產(chǎn)品中，蝦蟹(甲殼)類和貝類為水產(chǎn)品的主要致敏食物,，而原肌球蛋白是其中主要的過敏原,，其引起的過敏癥狀日趨復(fù)雜和嚴(yán)重。而傳統(tǒng)的檢測方法中,，質(zhì)譜技術(shù)的儀器成本和操作要求高,，并且用SDS電泳分離蛋白導(dǎo)致蛋白變性，對被檢食品樣品有損害,；PCR檢測技術(shù)用來檢測加工食品可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果,；免疫學(xué)檢測技術(shù)、膠體金試紙條檢測,、磁性免疫層析法及生物傳感器檢測法等步驟繁瑣且都需要抗體,。上海海洋大學(xué)的盧瑛等人發(fā)明了紅外衰減全反射法快速鑒定和檢測過敏原原肌球蛋白。

圖3 不同水產(chǎn)品的光譜

癌癥早期診斷

隨著FTIR技術(shù)的不斷進(jìn)步,，為癌癥的早期診斷提供了可能,，針對這方面的報道也越來越多。例如,，原發(fā)性膽囊癌細(xì)胞缺乏典型的臨床表現(xiàn),，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)屬中晚期，術(shù)后5年生存率不到5%,。而早期原發(fā)性膽囊癌術(shù)后5年生存率可達(dá)100%,，早期診斷是提高療效、改善預(yù)后的關(guān)鍵,。西安交大醫(yī)學(xué)院diyi附屬醫(yī)院普外科的孫學(xué)軍等人通過賽默飛世爾的紅外光譜儀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膽囊癌組織與正常膽囊組織的紅外光譜具有顯著差異,，可作為癌癥早期診斷的手段,。

中科院同步輻射實(shí)驗(yàn)室的馬曉冬等人認(rèn)為檢測細(xì)胞和組織樣品取樣較為不便，所以根據(jù)中醫(yī)理論——人的指甲在一定程度可以反映出內(nèi)臟器官的生理病理變化,，建立了通過指甲紅外光譜判斷消化道癌的方法,。之前還有人通過指甲的紅外光譜，對鼻咽癌進(jìn)行早期診斷。

結(jié)直腸癌化療療效的實(shí)時監(jiān)測

在結(jié)直腸癌的化療中,，常采用5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,。臨床上對放化療效果的監(jiān)測主要是通過電子顯微結(jié)腸鏡、CT和B超等手段,，只是在組織水平進(jìn)行監(jiān)測,，而組織變化之前腫瘤細(xì)胞內(nèi)部構(gòu)成早已發(fā)生改變，尚未出現(xiàn)臨床癥狀和影像學(xué)改變,。西安交大醫(yī)學(xué)院diyi附屬醫(yī)院普外科的劉棟等人利用賽默飛世爾的iN10 MX型顯微紅外光譜儀,，對不同時期腫瘤細(xì)胞中的脂類、氨基酸殘基,、DNA和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行檢測,，研究出實(shí)時無創(chuàng)監(jiān)測腫瘤化療療效的有效方法。

圖4 隨凋亡時間延長蛋白質(zhì)α螺旋和NH二級結(jié)構(gòu)吸收峰強(qiáng)降低,，

提示細(xì)胞α螺旋解鏈,，細(xì)胞凋亡（a: Control; b: 12h; c: 24h; d: 48h）

不同制備條件對抗體蛋白的影響

免疫膠乳指特定抗體或抗原固定于膠乳顆粒表面形成具有免疫學(xué)性質(zhì)的膠乳顆粒。傳統(tǒng)物理吸附法固定大分子蛋白容易脫落,，用共價偶聯(lián)的方法制備免疫膠乳,，蛋白質(zhì)在吸附于膠乳顆粒表面的過程中結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，不同偶聯(lián)條件對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)影響不同,。華南理工大學(xué)的俞思明等人利用壓片法測得免疫膠乳的紅外透射光譜,，并結(jié)合多種算法，分析了不同條件下共價偶聯(lián)對抗體蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響,。

隨著FTIR軟件和硬件技術(shù)的不斷進(jìn)步,，相信未來紅外光譜法在蛋白質(zhì)檢測各領(lǐng)域中的應(yīng)用也會更加普遍，同時將由離體分析蛋白質(zhì)向在體分析方向發(fā)展,，這對化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都將具有重大意義,。