以下內(nèi)容為上海儀橙科技對熒光蛋白激發(fā),，起源,，用途的整理匯總,，內(nèi)容來自網(wǎng)絡(luò),，僅供各位寶寶參考:

在光譜的綠光區(qū)（500nm-525nm）已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種熒光蛋白，而且來源廣泛,，包括不同種屬的Aequorea ,、橈足類動物、文昌魚以及珊瑚,。然而多數(shù)有齊聚反應(yīng),，即使好的熒光蛋白與EGFP相比，也沒有明顯的優(yōu)點,。或許目前活細胞成像好的選擇是GFP衍生的Emerald（祖母綠）,，它與EGFP的特性相似,。Emerald包含F64L和S65T突變，另外還有四個點突變從而改進了折疊,、37℃時的突變率以及亮度,。雖然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分,，可能在某些環(huán)境下其定量成像會受到影響,。

熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)改變了生命科學研究。它像一盞"分子燈",，讓科學家能直接觀察細胞內(nèi)基因活動,、蛋白質(zhì)互作等原本看不見的過程。綠色熒光蛋白（GFP）在經(jīng)過改良后變得更亮更穩(wěn)定,，又衍生出紅,、藍、黃等不同顏色的熒光蛋白,，甚至能隨環(huán)境變化或光照改變發(fā)光的狀態(tài),，得以滿足多色標記,、深層組織成像等需求。現(xiàn)在的市場上新型熒光蛋白的理化特性（如亮度提升,、光穩(wěn)定性優(yōu)化,、光譜紅移等）為突破成像技術(shù)的物理極限提供物質(zhì)基礎(chǔ)；而先進技術(shù)的應(yīng)用需求（如多色同步追蹤,、深層組織成像）又反向推動熒光蛋白的定向改造與功能創(chuàng)新,，持續(xù)拓展著生命科學的認知邊界。

下面主要介紹GFP及其衍生型熒光蛋白：

1,、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）

（1）來源

19世紀70年代下村修成功純化了這種發(fā)光的蛋白質(zhì),，并且命名為水母素多年以后，下村修隔壁的一位科學家道格拉斯普瑞舍（Douglas C. Prasher）從水母中成功克隆了GFP的基因序列,，也想讓GFP在生物體內(nèi)發(fā)光,，但是卻沒有成功。不過這位科學家離開的時候他將提取到的基因序列贈予了許多對GFP感興趣的實驗室,。1994年馬丁查菲實驗室的研究生吉亞·奧伊斯基興（Ghia Euskirchen）把GFP的基因序列轉(zhuǎn)入了大腸桿菌和線蟲中,，成功看到了綠色熒光。這一發(fā)現(xiàn)證明了GFP能夠和其他蛋白在細胞內(nèi)融合表達并且不需要熒光素這樣的分子輔助就可以發(fā)出熒光,?？茖W家們通過熒光就可定位其融合的蛋白，研究蛋白質(zhì)在活細胞中的定位和功能,。

（2）性質(zhì)

GFP由238個氨基酸殘基組成,。GFP序列中的65-67位殘基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自發(fā)形成熒光發(fā)色基團——對羥基苯咪唑啉酮GFP的激發(fā)光譜在400nm附近有一個主激發(fā)峰，在470nm附近有一個次激發(fā)峰,。發(fā)射光譜在505nm附近有一尖銳的主發(fā)射峰,，在540nm附近有一肩峰GFP的化學性質(zhì)相當穩(wěn)定，無光漂白現(xiàn)象（Photobleaching）,，用甲醛固定和石蠟包埋亦不影響其熒光性質(zhì),。在細胞生物學與分子生物學領(lǐng)域中，綠色熒光蛋白基因常被用作報告基因,。

（3）野生型

野生型GFP（wild type GFP, wtGFP）從一開始就引起了人們極大的興趣,，而且被用作新型的簡單報告基因及體內(nèi)標記，但GFP在異源生物體中的表達并非那么簡單,。例如,，研究人員很早就發(fā)現(xiàn)需要在較高的溫度下孵育才能在細胞或生物體中表達GFP，并且wtGFP在37℃的熱穩(wěn)定性差,。這些都阻礙了它在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用,。這些難題促使人們進一步篩選分離wtGFP的變體。現(xiàn)在,，人們已經(jīng)找到了熒光強度更強且更耐熱的變體,。這些變體多數(shù)為經(jīng)突變的脫輔基蛋白,，它們可防止高溫導致的錯誤折疊。近年來出現(xiàn)的新型wtGFP基因突變體的激發(fā)和發(fā)射譜發(fā)生了改變,，熱穩(wěn)定性和熒光強度得到了提高,，GFP報告基因在小鼠中的應(yīng)用就是以這些變體作為基礎(chǔ)的。

（4）增強型綠色熒光蛋白（EGFP）

現(xiàn)在,，應(yīng)用最為廣泛的是紅移變體增強型GFP（EGFP）,。諸如EGFP這些紅移變體的最大激發(fā)峰發(fā)生紅向移動，大約為490nm,，這一波長也恰好是多數(shù)分光設(shè)備,、流式細胞儀及共聚焦顯微鏡的常用波長。EGFP有兩個氨基酸突變,，當被藍光激發(fā)時,，它發(fā)出的熒光要比wtGFP亮30-40倍。wtGFP和包括EGFP在內(nèi)的多數(shù)變體半衰期長,，所以不適合精確追蹤表達的減少或損耗,。

（5）增強型黃色熒光蛋白（EYFP）

另一種紅移變體是增強型黃色熒光蛋白（EYFP），該變體有四個氨基酸突變,。在527nm時,，EYFP的發(fā)射光從綠色變?yōu)辄S綠色。EYFP熒光的亮度水平與EGFP相當,。EYFP 抗酸性差,、對鹵化物敏感，使它的應(yīng)用受到限制,。在EYFP 基礎(chǔ)上改進的突變體mCitrine[21]和mVenus[22]是目前應(yīng)用最多的黃色熒光蛋白,。

（6）增強型藍色熒光蛋白（EBFP）

在光譜的另一端是藍色/藍綠色變體，包括增強型藍色熒光蛋白（EBFP）變體,。它有四個氨基酸突變,，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為380nm-405nm和440nm,。由于這些突變改進了蛋白折疊和發(fā)色團形成的效率,，所以也增強了所發(fā)出熒光的亮度（與藍色變體相比）和蛋白溶解性。但不足之處,，就是EBFP產(chǎn)生的熒光信號 大致與wtGFP相當,。藍色熒光蛋白發(fā)光較弱，抗光漂白和抗酸性較差,，用于細胞成像時背景信號高,。針對EBFP開發(fā)的3個更亮的突變體：Azurite (亮度是EBFP的1.6 倍)、EBFP2(亮度是EBFP的2倍,，mTagBFP(亮度是EBFP的3.7倍),。最亮的藍色熒光蛋白,。mTagBFP 是由紅色熒光蛋白TagRFP突變而來。

（7）增強型藍綠色（青色）熒光蛋白（ECFP）

增強型藍綠色熒光蛋白（ECFP）是發(fā)出藍色/藍綠色熒光的另一種變體,，產(chǎn)生的熒光信號要比wtGFP強,。ECFP有六個氨基酸突變，發(fā)射光譜從綠色遷移到藍綠色,，最大激波長在433nm（主峰）和453nm（次峰）,，最大發(fā)射在475nm，于510nm處有一肩峰,，ECFP另一特點是比其它藍色/藍綠色變體光漂白效應(yīng)弱,，而且比EBFP的亮度強。值得一提的是,，wtGFP的主要綠色熒光變體,，如EGFP等已經(jīng)在ES細胞、基因打靶和轉(zhuǎn)基因小鼠研究中得到充分應(yīng)用,。

2,、藍色及藍綠色熒光蛋白（多數(shù)用于亞細胞地位，信號強度高）

雖然EBFP（BFP）是Aequorea GFP來源的最早的光譜變體之一,，但其亮度低,、光穩(wěn)定性差，使其很久以來沒有引起多數(shù)研究者的注意,。改進的藍色Aequorea 熒光蛋白變體與EBFP相比,，亮度和光敏感性有明顯增強。這些新的變體被命名為Azurite（石青或藍銅礦）,、強力增強型藍色熒光蛋白2（strongly enhanced blue fluorescent protein 2, SBFP2）及EBFP2,，它們第一次使得活細胞在藍色光譜區(qū)域成功地長時間成像成為可能。即使這三種熒光蛋白在高濃度的微環(huán)境中表現(xiàn)出很弱的二聚體特性,，但是它們能夠在與亞細胞定位的靶蛋白融合中有效地發(fā)揮作用,，并且它們能夠很容易地通過濾光片設(shè)備與標準的BFP及4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）一起成像。所有這些BFP變體都可以通過A206K突變改造成真正的單體,，而且這種突變不會影響它們的特性,。更重要的是，亮度強,、光穩(wěn)定性強的藍色熒光蛋白EBFP2,，是EGFP在活細胞中FRET的很好的供體。

3,、黃色熒光蛋白

熒光蛋白的改造遵循這樣一個宗旨,，那就是越紅越好.普遍認為，長波長光子的激發(fā)對細胞和組織的光毒性小，且自體熒光和動物組織的光吸收都是最小,。這些因素意味著紅色的熒光基團對比度提高（因為背景應(yīng)該降低）,，且更適合于體內(nèi)成像。于是,，熒光蛋白的改造慢慢向紅色偏移,。

黃色熒光蛋白最早的變體EYFP雖然仍被廣泛應(yīng)用，但由于其pK a值高,、對鹵化物敏感,，導致EYFP的應(yīng)用還很不理想。單體形式的變體檸檬黃（mCitrine）和維納斯（mVenus）是目前應(yīng)用最多的黃色熒光蛋白探針,。

另一種很有應(yīng)用潛力的黃色熒光蛋白是能量轉(zhuǎn)移黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein for energy transfer, YPet）,，它經(jīng)合成的DNA重排獲得，與熒光激活的細胞分選術(shù)結(jié)合能夠增強FRET中藍綠色熒光蛋白和黃色熒光蛋白的配對,。YPet是已經(jīng)開發(fā)的亮度強的黃色熒光蛋白,，并且有很好的光穩(wěn)定性。YPet對酸性環(huán)境的耐受性要比mVenus及其它黃色熒光蛋白變體強,。

4,、橙色熒光蛋白

在橙色和紅色波長（約560nm到650nm）光譜區(qū)僅僅開發(fā)了幾種探針。盡管如此,，現(xiàn)有的這幾種光譜型的蛋白都是從珊瑚中分離得到的,，并且在多種成像情景中顯現(xiàn)出應(yīng)用潛力，但在對橙色區(qū)域熒光蛋白的命名中存在混亂,。通常被命名為紅色熒光蛋白（視覺效果像櫻桃紅）RFP的探針如DsRed,、TagRFP及tdTomato，實際上具有明顯的橙色多于紅色的發(fā)射譜,。不考慮顏色的指示,，用標準的四甲基羅丹明異硫氰酸脂（tetramethyl-rhodamine isothiocyanate, TRITC）濾光片設(shè)備，橙色光譜型的蛋白在多種顏色,，如藍綠色,、綠色和紅色情景中更易于成像。

5,、紅色熒光蛋白

紅色熒光蛋白(drFP583 )是在克隆的綠色熒光蛋白(GFP)的基礎(chǔ)上改造的,，并在此基礎(chǔ)上進行了大量的研究和改造。通過對GFP進行基因突變和定向誘變技術(shù),，科學家們成功開發(fā)出了幾種變體,，其中之一就是紅色熒光蛋白（RFP,，在綠色光源595-600nm的照射下可發(fā)射紅色熒光,，因此，人們對它進行了一系列修飾和改進,，得到了寡聚化程度低(甚至單體)和成熟速率快的突變體,，商業(yè)化命名為DsRed,。與GFP相比，DsRed的激發(fā)和發(fā)射波長較長,，其發(fā)射峰位于培養(yǎng)基,、組織培養(yǎng)器材及細胞成分等產(chǎn)生的熒光背景范圍之外，具有較高的信噪比;而且在細胞內(nèi)熒光轉(zhuǎn)換效率高,，更易檢測,。較早報道的紅色熒光蛋白(DsRed) 的突變體有mBanana、mOrange,、dTomato,、mTangerine、mStrawberry 和mCherry,。

在活細胞及動物全身成像中需要表現(xiàn)較好的紅色熒光蛋白,，主要是由于在多種顏色成像實驗中需要紅色探針，另外基于較長的激發(fā)波長產(chǎn)生的光毒性較小,，可以用來探測較深的生物組織,。最新研究進展是，通過mRFP1發(fā)色團殘基的直接突變產(chǎn)生的新的熒光蛋白,，得到的單體熒光蛋白發(fā)射峰在560nm～610nm,，并以相應(yīng)的水果名字來命名。這其中mStrawberry和mCherry,，發(fā)射峰分別為596nm和610nm,，亮度分別為EGFP的75%和50%左右。mCherry的光穩(wěn)定性要遠強于mStrawberry,，所以長期成為成像實驗中mRFP1好的替代品,。這些以水果命名的熒光蛋白單體與mKO和TagRFP共同補了水母紅移熒光蛋白（如YPet）與大量低聚紅色珊瑚熒光蛋白間的空白，并且目前已經(jīng)商業(yè)化,。雖然,，某些熒光蛋白缺乏許多成像實驗所需要的亮度和光穩(wěn)定性，但是它們的存在提示我們,，最終可以找到跨越整個可見光譜的亮度高,、穩(wěn)定性強的單體探針。

6,、熒光蛋白突變體

熒光素和熒光素酶

（1）螢火蟲熒光素酶

目前常用的螢火蟲熒光素酶來源于北美螢火蟲(Photinuspyralis),，是一個61kDa的單體酶，無需表達后修飾,，直接具有全酶活,，反應(yīng)需要底物熒光素以及ATP、O2、Mg2+等的參與,。

（2）海腎熒光素酶

海腎熒光素酶來源于海腎（Renillareniformis）,，是一個36kDa的單體酶，表達后無需修飾,，即可具有全酶活,。反應(yīng)只需要腔腸素（Coelenterazine）和O2參與。

（3）Gussia熒光素酶

Gussia熒光素酶來源于夏威夷水域的一種大型海洋溡腳類動物Gaussiaprinceps,，是一個19.9kDa的單體酶,，只有185個氨基酸，具有一個16aa的分泌性信號肽,，可以被細胞分泌到細胞外,，可以引導熒光素酶分泌到細胞培養(yǎng)上清中，從而無需裂解細胞即可檢測報告基因活性,。

  以上是小編摸爬滾打?qū)晒獾鞍椎慕馕?，認知，如果寶寶需要對應(yīng)的設(shè)備可以后臺聯(lián)系我,，知無不盡,，盡無不言。