色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用(吸附,、分配,、離子吸引、排阻,、親和)的大小,、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同,，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法,、層析法,。
高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相),、離子交換色譜法,、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。
A .液固色譜法
使用固體吸附劑,，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離,。分離過程是一個(gè)吸附—解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁,，粒度5~10µm,。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物,，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾,。常用于分離同分異構(gòu)體。
B .液液色譜法
液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC),。
正相色譜法 ——— 采用極性固定相(如聚乙二醇,、氨基與腈基鍵合相)；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷),，常加入乙醇,、異丙醇、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間,。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類,、胺類、羰基類及氨基酸類等),。
反相色譜法 ——— 一般用非極性固定相(如C18,、C8)；流動(dòng)相為水或緩沖液,，常加入甲醇,、乙腈、異丙醇,、丙酮等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間,。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用*為廣泛,，據(jù)統(tǒng)計(jì),，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。
C .離子交換色譜法
固定相是離子交換樹脂,，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架,，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基(稱陽離子交換樹脂)或季氨基(陰離子交換樹脂),。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換,，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相,。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外,，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度,，進(jìn)而影響其與固定相的作用,，流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高,，不利于樣品的解離,，導(dǎo)致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸,、氨基酸,、多肽及核酸。
D .離子對(duì)色譜法
又稱偶離子色譜法,，是液液色譜法的分支,。它是根據(jù)被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后,，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善,。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì),。 分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉,、辛烷磺酸鈉等,。另外高氯酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。
分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽,，如四丁基溴化銨,、四丁基銨磷酸鹽。
離子對(duì)色譜法常用短鏈反相色譜柱柱(即C8),，流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水,，水中加入3~10mmol/L的離子對(duì)試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離,。被測(cè)組分保時(shí)間與離子對(duì)性質(zhì),、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值,、離子強(qiáng)度有關(guān),。
E . 排阻色譜法
固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑,。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中,，滯留時(shí)間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中,，直接隨流動(dòng)相流出,，它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物,，如組織提取物、多肽,、蛋白質(zhì),、核酸等。
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