一、引言

       隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米顆粒在眾多領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，如生物醫(yī)藥,、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等,。在這些應(yīng)用中,，精確測(cè)定納米顆粒的尺寸、濃度,、表面電荷等特性至關(guān)重要,，因?yàn)檫@些參數(shù)直接影響著納米材料的性能、穩(wěn)定性以及與生物系統(tǒng)的相互作用,。傳統(tǒng)的納米顆粒分析技術(shù),，如電子顯微鏡（EM）和掃描探針顯微鏡（SPM），雖然能夠提供高分辨率的圖像,，但樣品制備復(fù)雜,、檢測(cè)通量低，且通常只能對(duì)靜態(tài)樣品進(jìn)行分析,，難以滿足對(duì)納米顆粒在溶液中動(dòng)態(tài)行為研究的需求,。動(dòng)態(tài)光散射（DLS,圖1B）技術(shù)作為一種常用的光學(xué)集合技術(shù)，長(zhǎng)期以來被廣泛應(yīng)用于納米顆粒分散體系的分析,，能夠快速,、準(zhǔn)確地測(cè)定顆粒尺寸。然而,，DLS 在面對(duì)多分散樣品時(shí)可靠性下降,，其獲得的強(qiáng)度加權(quán)平均尺寸（“z 平均"）并不總能準(zhǔn)確反映樣品的真實(shí)組成。此外,，通過經(jīng)典反卷積算法對(duì)相關(guān)函數(shù)進(jìn)行分析以提取例如雙峰分布的能力,，實(shí)際上僅限于僅包含兩種或至多三種尺寸顆粒類型的樣品，且每種顆粒類型的尺寸差異需在實(shí)踐中大于 3:1,。納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA,圖1A）的出現(xiàn)為納米顆粒的表征提供了一種全新的解決方案,，它能夠?qū)崟r(shí)、逐個(gè)地跟蹤和分析納米顆粒在溶液中的布朗運(yùn)動(dòng),，從而獲取顆粒的尺寸,、濃度等信息，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)的諸多不足,。

圖1，NTA(A)與DLS（B）的原理圖

二,、NTA技術(shù)原理

       NTA 技術(shù)基于激光光散射原理,，一束精細(xì)聚焦的激光束穿過含有納米顆粒稀懸浮液的樣品池。激光束在液體樣品與光學(xué)元件的界面處發(fā)生折射,，使其路徑接近與玻璃 - 樣品界面平行,。位于光束內(nèi)的顆粒，通過與光束軸垂直對(duì)齊的常規(guī)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行可視化觀察,，該顯微鏡收集視野內(nèi)每個(gè)顆粒散射的光,。由于 NTA 本質(zhì)上并非成像技術(shù)，系統(tǒng)的總放大倍數(shù)相對(duì)適中,，對(duì)于適當(dāng)稀釋的樣品,，顆粒在顯微鏡視野內(nèi)呈現(xiàn)為在布朗運(yùn)動(dòng)下移動(dòng)的光散射中心。拍攝一段時(shí)長(zhǎng)通常為20 - 60秒（每秒30幀左右）的運(yùn)動(dòng)顆粒視頻,，借助專有分析程序逐幀處理,。程序自動(dòng)識(shí)別、定位每個(gè)顆粒,，跟蹤其幀間移動(dòng),。顆粒識(shí)別閾值、相機(jī)增益與快門速度等參數(shù)可由用戶根據(jù)樣品類型調(diào)整,，以優(yōu)化圖像,。擴(kuò)散進(jìn)入散射體積的顆粒被識(shí)別并跟蹤，直至其離開光束或靠近相鄰顆粒致跟蹤終止,，有效避免因顆粒軌跡交叉導(dǎo)致的錯(cuò)誤結(jié)果,。依據(jù)布朗運(yùn)動(dòng)理論，球形顆粒的擴(kuò)散系數(shù)（Dt）與粒徑遵循斯托克斯 - 愛因斯坦關(guān)系：

       其中KB為玻爾茲曼常數(shù),，T為絕對(duì)溫度，η為粘度,，d為流體動(dòng)力學(xué)直徑,。顆粒在溶液中的布朗運(yùn)動(dòng)速度與其粒徑有關(guān)。較小的顆粒由于受到的流體阻力較小,，布朗運(yùn)動(dòng)速度更快,。反之，較大顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)更慢,。通過分析顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)軌跡,，可以計(jì)算出顆粒的擴(kuò)散系數(shù)，進(jìn)而推算出顆粒的粒徑,。

三,、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

1,、多參數(shù)同時(shí)分析能力

       與傳統(tǒng)的 DLS 技術(shù)只能提供強(qiáng)度加權(quán)平均尺寸不同，NTA 能夠在跟蹤顆粒布朗運(yùn)動(dòng)計(jì)算尺寸的同時(shí),，測(cè)量顆粒散射光的強(qiáng)度,，從而生成強(qiáng)度 - 尺寸二維圖。這使得即使對(duì)于非單分散的樣品,，如不同直徑混合的二氧化鈦納米顆粒,，也能通過二維圖更清晰地分辨出各個(gè)顆粒群體。此外,，NTA 還可通過引入電極施加電場(chǎng),，分析帶電顆粒在電場(chǎng)中的電泳遷移率，實(shí)現(xiàn)顆粒尺寸與電泳遷移率的同時(shí)測(cè)量,。以羧化的 150nm 顆粒為例,，在施加電場(chǎng)前，可通過分析其布朗運(yùn)動(dòng)確定顆粒大小,，施加 30V 電場(chǎng)后,，顆粒向陽極移動(dòng)，其電泳軌跡可被可視化并分析,，且布朗運(yùn)動(dòng)不受電泳運(yùn)動(dòng)的影響,，能夠同時(shí)提取顆粒的尺寸和電泳信息。

2,、高分辨率的顆粒尺寸分布測(cè)定

       NTA 技術(shù)能夠以超越 DLS 的分辨率分辨不同顆粒尺寸,，對(duì)于多分散體系具有顯著優(yōu)勢(shì)。如對(duì) 100nm 和 300nm 聚苯乙烯校準(zhǔn)微球的混合物進(jìn)行分析,，能夠清晰地呈現(xiàn)出雙峰分布,，并且以顆粒數(shù)量為函數(shù)展示尺寸分布，可準(zhǔn)確獲得每個(gè)尺寸類別的顆粒濃度（顆粒數(shù)/ml）,，為復(fù)雜樣品中不同尺寸顆粒群體的定量分析提供了有力手段,。

3、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)顆粒動(dòng)態(tài)變化

       NTA 通過光學(xué)顯微鏡成像和顆粒追蹤算法,，能夠直觀地觀察到納米顆粒在溶液中的運(yùn)動(dòng)軌跡和行為,，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)納米顆粒的聚集、分散等動(dòng)態(tài)過程,，有助于深入理解納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)和行為變化,。由于 NTA 是對(duì)單個(gè)顆粒進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤分析，它能夠捕捉到顆粒在溶液中的動(dòng)態(tài)變化過程,。例如,，在研究病毒顆粒與金屬鹽溶液相互作用時(shí)，隨著時(shí)間推移,，病毒顆粒表面形成金屬涂層,，導(dǎo)致其折射率增加,，雖然顆粒直徑無顯著變化，但通過 NTA 的二維強(qiáng)度 - 尺寸圖可實(shí)時(shí)觀察到這一變化,，直觀地反映出顆粒性質(zhì)的動(dòng)態(tài)演變,。

四、NTA儀器構(gòu)成

       典型的NTA儀器主要由激光光源,、顯微鏡、樣品池,、相機(jī)及數(shù)據(jù)分析軟件組成（圖2）,。激光光源提供穩(wěn)定且聚焦良好的光束；顯微鏡用于觀察顆粒散射光,，其光學(xué)性能影響顆?？梢暬Ч粯悠烦厝莘e約250µl,、深度500µm,，帶有Luer接口，方便通過注射器進(jìn)樣,，且能確保樣品在分析前20秒達(dá)到熱平衡,；相機(jī)（CCD或CMOS相機(jī)）捕捉顆粒散射光圖像，其靈敏度與幀率對(duì)數(shù)據(jù)采集質(zhì)量關(guān)鍵,；數(shù)據(jù)分析軟件則負(fù)責(zé)處理視頻數(shù)據(jù),，實(shí)現(xiàn)顆粒追蹤、參數(shù)計(jì)算與結(jié)果呈現(xiàn),。

圖2,，NTA的結(jié)構(gòu)示意圖

五、NTA技術(shù)在多領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展

       納米顆粒跟蹤分析儀的用途非常廣泛,，在科研系統(tǒng)的研究領(lǐng)域里,，可以在脂質(zhì)體和藥物傳遞納米顆粒、蛋白質(zhì)聚集物,、10-1000nm金屬和無機(jī)納米顆粒,、高分子納米懸浮液、稀土納米顆粒及量子點(diǎn)/多層碳納米管,、疫苗研發(fā),、納米氣泡、納米毒理學(xué)和生物標(biāo)記物,、細(xì)胞外泡(外泌體和微泡)等領(lǐng)域進(jìn)行粒徑大小測(cè)量,、濃度測(cè)量、熒光純度檢測(cè)及Zeta電位測(cè)量,。因此其在生物醫(yī)學(xué),、藥物開發(fā),、納米材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué),、化學(xué)工程等領(lǐng)域廣泛使用,。

圖3,、NTA的應(yīng)用領(lǐng)域

1,、藥物遞送

       通過精確測(cè)量顆粒尺寸分布和濃度，研究人員可以更好地優(yōu)化遞送載體的設(shè)計(jì)和制備工藝,，確保藥物能夠以合適的粒徑和濃度到達(dá)目標(biāo)部位,，從而提高藥物的療效和安全性，這也是在藥物研發(fā)過程中對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行測(cè)量具有重要意義的原因,。

2,、材料科學(xué)領(lǐng)域

       在納米材料合成與表征中，NTA用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)納米顆粒生長(zhǎng)過程,，追蹤粒徑,、濃度隨時(shí)間變化，助力優(yōu)化合成工藝參數(shù),，如制備金納米顆粒時(shí),，精確調(diào)控粒徑分布。在材料穩(wěn)定性研究方面,，可檢測(cè)顆粒團(tuán)聚,、沉降等變化，評(píng)估不同環(huán)境條件（溫度,、pH,、離子強(qiáng)度）對(duì)材料穩(wěn)定性影響，為納米材料長(zhǎng)期儲(chǔ)存與應(yīng)用提供依據(jù),。

3,、病毒學(xué)與疫苗生產(chǎn)

       準(zhǔn)確計(jì)數(shù)和測(cè)量病毒、噬菌體及其聚集體對(duì)于疫苗研發(fā),、生產(chǎn)及質(zhì)量控制至關(guān)重要,，保障疫苗的質(zhì)量和穩(wěn)定性，確保疫苗在預(yù)防疾病方面的有效性和安全性,。

4,、蛋白質(zhì)聚集物

       在細(xì)胞培養(yǎng)、純化,、配方,、包裝和儲(chǔ)存等多個(gè)單元操作過程中都可能發(fā)生蛋白質(zhì)聚集。確定蛋白質(zhì)聚集的狀態(tài)和動(dòng)力學(xué)對(duì)于提高產(chǎn)品穩(wěn)定性和優(yōu)化生產(chǎn)過程具有重要意義,。

5,、環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域

       監(jiān)測(cè)環(huán)境水樣,、大氣顆粒物中的納米顆粒，分析其來源,、成分,、遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律。如研究水中金屬納米顆粒污染,，NTA結(jié)合其他分析技術(shù),，識(shí)別顆粒種類、粒徑范圍,，評(píng)估潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn),，為環(huán)境監(jiān)測(cè)與污染治理提供數(shù)據(jù)支持。

6,、納米氣泡

       納米氣泡具有廣泛的應(yīng)用潛力，包括在藥物遞送,、清潔和消毒等方面,。NTA技術(shù)在納米氣泡研究中發(fā)揮著重要作用，它能夠直接在溶液中可視化納米氣泡,，并提供關(guān)于氣泡尺寸和濃度的信息,。

7、外泌體外囊泡

       保證外泌體的原始狀態(tài)條件下,，對(duì)外泌體,，外囊泡進(jìn)行快速實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)，測(cè)量參數(shù)包括顆粒粒徑,、散射光強(qiáng),、濃度等，可對(duì)抽提獲得的外泌體進(jìn)行粒徑大小及數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),。搭配響應(yīng)的激光器與濾片,，可在復(fù)雜背景條件下，使用熒光抗體標(biāo)記外泌體,，可對(duì)外泌體進(jìn)行熒光測(cè)量,。

六、總結(jié)

       納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA）能實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)納米顆粒的實(shí)時(shí),、同步多參數(shù)分析,，提供粒徑、濃度,、表面電荷等豐富信息,，這是傳統(tǒng)方法難以企及的。對(duì)于多分散體系,，NTA可精準(zhǔn)分辨不同粒徑顆粒群體,，準(zhǔn)確反映樣品真實(shí)情況,。操作相對(duì)簡(jiǎn)便，樣品制備要求低,，分析速度快,，能在短時(shí)間內(nèi)給出結(jié)果，大幅提高研究效率,。

       NTA憑借其可靠的原理,、先進(jìn)的儀器設(shè)計(jì)、簡(jiǎn)便的操作流程以及優(yōu)異的性能優(yōu)勢(shì),，在納米材料研究的各個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力,。通過與傳統(tǒng)納米顆粒分析方法的對(duì)比，凸顯了其在多參數(shù)分析,、高分辨率粒徑測(cè)定,、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等方面的不可替代性。隨著納米科技的持續(xù)發(fā)展,，NTA技術(shù)有望在更多領(lǐng)域得到深入應(yīng)用與拓展,，不斷推動(dòng)納米材料的創(chuàng)新研發(fā)、產(chǎn)品質(zhì)量提升以及納米技術(shù)與其他學(xué)科的交叉融合,，為解決諸多科學(xué)與工程難題提供有力的技術(shù)保障,，開啟納米表征技術(shù)的新篇章。

關(guān)于納米顆粒跟蹤分析儀LighTracker

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