目錄:上海烜雅生物科技有限公司>>核酸檢測試劑盒>>熒光PCR法>> 50T辣椒輕斑駁病毒探針法 qRT-PCR 試劑盒
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T/盒 |
|---|---|---|---|
| 貨號 | XY-D-1513 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
| 主要用途 | 科研 | 英文名稱 | Pepper Mild Mottle Virus Probe qRT-PCR Kit |
| 保存條件 | -20℃保存 | 有效期 | 24個月 |
產(chǎn)品簡介：
辣椒輕斑駁病毒（Pepper Mild Mottle Virus,，PMMoV）是一種影響辣椒作物的植物病原性病毒,，屬于煙草花葉病毒科,。該病毒是一種單鏈正義 RNA 病毒,，基因長度約為 6.4 knt,。這種病毒在全球范圍內(nèi)對甜椒、辣椒和觀賞辣椒品種構(gòu)成嚴重威脅,，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降,。辣椒輕斑駁病毒的典型癥狀包括葉片褪綠、發(fā)育不良,、果實結(jié)構(gòu)扭曲和塊狀,。其傳播途徑主要包括機械傳播和通過受感染的種子傳播。由于該病毒一旦感染植物就無法治療,，因此控制這種疾病的最好方法是使用經(jīng)過病原體檢測和處理的種子進行種植,。因此快速靈敏診斷辣椒輕斑駁病毒具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測辣椒輕斑駁病毒的含內(nèi)參試劑盒,。
產(chǎn)品特點：
1.即開即用,，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，分析靈敏度高,，可以達到 100 拷貝/反應(yīng)。
3.提供陽性對照,，便于制備標準曲線和用作擴增對照,，排除假陰性結(jié)果。
4.含識別內(nèi)源性內(nèi)參的引物和探針,，便于排除 RT-PCR 假陰性樣本,。
5.特異性高，靶分子的引物和探針是根據(jù)辣椒輕斑駁病毒 RNA 高度保守區(qū)設(shè)計,，不會跟其他生物的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng),。
6.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為 5 個數(shù)量級,。
7.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法 RT-PCR 反應(yīng),。
8.辣椒輕斑駁病毒探針法 qRT-PCR 試劑盒只能用于科研。
產(chǎn)品參數(shù)：
產(chǎn)品規(guī)格
50T/盒,，可滿足一定規(guī)模的檢測需求,。
檢測方法
實時熒光PCR，具有快速,、準確,、靈敏等優(yōu)點。
試劑盒成分
探針法 qRT-PCR 緩沖液,、探針法 qRT-PCR酶混合液 v2,、熒光 PCR 專用模板稀釋液、辣椒輕斑駁病毒 qRT-PCR探針法引物-探針干粉,、辣椒輕斑駁病毒 qRT-PCR陽性對照(1×10E7 拷貝/μL),、使用手冊。
自備試劑
樣品 RNA,，超純水,，核酸純化試劑盒。
保存和運輸
低溫運輸,，-20℃保存,，保存期限為 24 個月。
使用方法：
一,、稀釋標準曲線樣品（以陽性對照 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。
1.標記 6 個離心管，分別為 6,、5,、4、3,、2,、1。
2.在各管中加入 45 μL 熒光PCR 專用模板稀釋液,。
3.在 6 號管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震蕩 1 分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用,。
4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭,，在 4 號管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線陽性樣品,。放冰上待用,。
二、樣品 RNA 的制備
7.如果有 N 個樣品,，最好設(shè)置 N+2 個提取,，多出的一個是制備 PC（樣品制備陽性
對照），一個是制備 NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂么_認是陽性的樣本作為陽性對照，用確認是陰性的樣本作為陰性對照,。
8.用自選方法純化樣品的 RNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù) RNA -提取試劑盒兼容， 也可以選購本公司的核酸-提取試劑,。
三,、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標記 N+9 個PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個用于標準曲線,。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標記 N+4 個 RT-PCR 管,，其中N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板）， 1 個用于 RT-PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。
10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)）：
成分樣品管
N+2 個RT-PCR
陰性對照標準曲線樣品管
（1-6 管）
探針法 qRT-PCR 緩沖液各 10 μL10 μL各 10 μL
探針法 qRT-PCR 酶混合液 v2各 1 μL1 μL各 1 μL
辣椒輕斑駁病毒 PCR 引物-探針
混合液(含內(nèi)參引物和探針)各 4 μL4 μL4 μL
N+2 個待測樣（含內(nèi)源性內(nèi)參）各 5 μL不加不加
超純水不加5 μL不加
第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液
（含內(nèi)參，1-6 號）不加不加各 5 μL（2 號樣
到 2 號管,，3 號樣
到 3 號管…）
四,、數(shù)據(jù)處理
12.陰性陽性判斷：沒有 Ct 讀數(shù)，或 Ct 大于 40 判為陰性結(jié)果,。有 Ct 讀數(shù),，Ct 值小于 40，熒光信號有對數(shù)增長，有典型擴增曲線判為陽性結(jié)果,。每個樣本需要對FAM 通道和 Cy5 通道的結(jié)果分別進行判定,，得到兩個結(jié)果。
13.實驗有效性判斷：如果擴增陽性對照或制備陽性對照 FAM 通道結(jié)果為陰性則整個實驗無效,，不需要分析數(shù)據(jù),，需要分析原因，可能是操作,、儀器和試劑三方面的原因,，重做擴增或制備或跟儀器和試劑廠家聯(lián)系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照 FAM 通道結(jié)果為陽性,，說明環(huán)境污染,，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù),，需要分析失敗原因,，直到污染消除。如果陽性對照和陰性對照正常,，則進入下一步分析樣本的有效性,。
14.樣本有效性判斷：如果樣本 FAM 通道的結(jié)果為陽性，則無論內(nèi)參通道的結(jié)果是陰性還是陽性,，樣本的結(jié)果均有效,。如果樣本結(jié)果為陰性，內(nèi)參通道結(jié)果也為陰性,， 則此樣品的陰性結(jié)果無效,。此樣品需要重新提取核酸和進行擴增。
15.如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，分別以陽性對照 FAM 通道和內(nèi)參通道的 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線,，陽性對照 FAM 通道讀數(shù)的標準曲線為斜線,，r2 必須大于 0.95，內(nèi)參通道讀數(shù)的標準曲線為一條跟 X 軸平行的橫線,。再以待測樣品的 Ct 值從陽性對照FAM 通道讀數(shù)的標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。
16.如果用于定性實驗,，對待測樣品,，如果其 FAM 通道的 Ct 沒有讀數(shù)、或 Ct 大于或等于 40 則均為陰性,，如果小于 40 則為陽性,。對任何 FAM 通道結(jié)果為陰性的待測樣本,，如果其對應(yīng)的內(nèi)參通道也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無效,，此樣品需要重復(fù)實驗,。
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