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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

牛朊病毒蛋白（Bos taurus Prion Protein）是牛朊病毒疾病的致病因子,，它由阮病毒基因（Prion Protein Gene，PRNP）編碼,，在朊病毒疾病的致病機(jī)   制中起到至關(guān)重要的作用,。己有的研究證實(shí)包括人在內(nèi)的動(dòng)物對(duì)朊病毒疾病的易感性與PRNP基因的多態(tài)性相關(guān)。牛朊病毒蛋白影響朊病毒的致病性及傳播,，因此快速檢測(cè)牛朊病毒蛋白具有重要意義,。本產(chǎn)品是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)牛朊病毒蛋白 mRNA 的試劑盒,。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用,，用戶只需要提供樣品 RNA 模板,。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高,，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng),。

3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品,。

4.特異性高,，引物是根據(jù)牛朊病毒蛋白 mRNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病原菌的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng),。

5.既可用于定性檢測(cè),，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為 5 個(gè)數(shù)量級(jí),。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng),。

7.牛朊病毒蛋白mRNA探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒,，可滿足一定規(guī)模的檢測(cè)需求,。

檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)熒光PCR，具有快速,、準(zhǔn)確,、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

試劑盒成分

探針法 qRT-PCR 緩沖液,、探針法 qRT-PCR酶混合液 v2,、熒光 PCR 專用模板稀釋液、牛朊病毒蛋白 mRNA 探針法引物-探針干粉,、牛朊病毒蛋白 mRNA陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7 拷貝/μL),、使用手冊(cè)。

自備試劑

樣品 RNA,。

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月,。

使用方法：

一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，

本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照,。1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6,，5,，4，3,，2,，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,，最好用帶芯槍頭,，下同）。

3.在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

4.換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

5.換槍頭,，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

二,、樣品 RNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取,，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性

對(duì)照）,，一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10 μL 上步所得 4 號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積  一樣,，以此作為 PC。另外用水作為 NC,。

8.用自選方法純化樣品的 RNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA- 提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的核酸-提取試劑,。

三,、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) RT-PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對(duì)照（用水做模板）， 6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個(gè)RT-PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照（直接用第 6 步第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)  置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好

后最后加）：

成分樣品管

N+2 個(gè)RT-PCR 陰

性對(duì)照管標(biāo)曲樣品管

（1-6 管）

探針法 qRT-PCR 緩沖液各 10 μL10 μL各 10 μL

探針法 qRT-PCR 酶混合液各 2 μL2 μL2 μL

牛朊病毒蛋白 mRNA RT-PCR

引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

待測(cè)樣品 RNA 模板各 5 μL不加不加

超純水不加5 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液

（1-6 號(hào)）

不加

不加各 5μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管,，

3 號(hào)樣到 3 號(hào)

管…）

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照或制備陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為陰性,，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無效,，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系,。如果擴(kuò)增陰性對(duì)照或制備陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性,，說明環(huán)境污染，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無效,，  不需要分析數(shù)據(jù),，需要跟廠家聯(lián)系，購(gòu)買新的引物和探針,。

13.如果陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照正常,，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析,。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 35,。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該小于 35，否則實(shí)驗(yàn)無效,。如果實(shí)驗(yàn)有效,，則分析待測(cè)樣品，如果無

Ct 或 Ct 大于或等于 35,，則為陰性,。如果 Ct 小于 35 則為陽(yáng)性。

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