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產(chǎn)品簡介：

放線菌屬（Actinomycesspp.）為原核細(xì)胞型微生物，革蘭染色陽性,，非抗酸性絲狀菌,，菌絲細(xì)長無分隔，有分枝,。放線菌廣泛分布于自然界,，種類繁多，  為人體的正常菌群成員,，可引起內(nèi)源性感染,。對人致病的主要有衣氏放線菌，牛放線菌可使牛和豬患病,。放線菌大多寄居于人和動物口腔,、上呼吸道、消化道及泌尿生殖道,，屬千正常菌群,。當(dāng)機(jī)體抵抗力降低、口腔衛(wèi)生不良,、拔牙或口腔黏膜受損時,，可致內(nèi)源性感染，引起放線菌病,。放線菌病是一種軟組織的化膿性炎癥,，若無繼發(fā)感染，多呈慢性肉芽腫，好發(fā)于面頸部,，也可進(jìn)人胃腸道和肺部,， 引起相應(yīng)感染。放線菌屬的流行給人類的生活帶來很大的困擾,，因此快速檢測放線菌屬具有重要意義,。本產(chǎn)品是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測放線菌屬的試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高,，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng),。

3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品,。

4.特異性高,，引物是根據(jù)放線菌屬 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒的DNA 發(fā)生交叉反應(yīng),。

5.既可用于定性檢測,，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數(shù)量級,。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng),。

7.放線菌屬通用探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒,，可滿足一定規(guī)模的檢測需求,。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速,、準(zhǔn)確,、靈敏等優(yōu)點。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix,、熒光 PCR 專用模板稀釋液,、超純水、放線菌屬通用 qPCR 引物-探針干粉,、放線菌屬通用qPCR 陽性對照(1E7 拷貝/μL),、使用手冊。

自備試劑

樣品 DNA,，超純水,，核酸純化試劑盒。

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為 24 個月。

使用方法：

一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能

污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照,。1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6,，5,，4，3,，2,，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,，最好用帶芯槍頭,，下同）。

3.在 6 號管中加入 5μL1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

4.換槍頭,，在 5 號管中加入 5μL1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所

得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

5.換槍頭,，在 4 號管中加入 5μL1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步所得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

二,、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取,，多出的一個是 PC（樣品制備陽性

對照）,，一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC,。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品 DNA- 提取試劑盒兼容,。也可以選購本公司的核酸-提取試劑,。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè)  置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好  后最后加）：

成分樣品管

N+3 個RT-PCR

陰性對照標(biāo)曲樣品管

（1-6）

2×Probe qPCR

Magic Mix各 10 μL10 μL各 10 μL

放線菌屬 qPCR 引物-探針

混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

待測樣本 DNA 模板7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6 號）

不加

不加各 7μL（1 號樣到 1 號管，2 號樣到 2 號管…）

11.蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

四,、數(shù)據(jù)處理

12.如果擴(kuò)增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性，則整個擴(kuò)增或制備實驗無  效,，不需要分析數(shù)據(jù),，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對  照或制備陰性對照結(jié)果為陽性,，說明環(huán)境污染,，則整個擴(kuò)增或制備實驗無效不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系,，購買新的引物和探針,。

13.如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效,，可以進(jìn)入后續(xù)分析,。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該小于 40,，否則實驗無效。如果實驗有效,，則分析待測樣品,，如果無

Ct 或 Ct 大于或等于 40，則為陰性,。如果 Ct 小于 40 則為陽性,。

選擇我們的放線菌屬通用探針法熒光PCR試劑盒，就是選擇精準(zhǔn),、高效,、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護(hù)航,！