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產(chǎn)品簡介：

巴貝斯蟲屬（Babesia spp.）主要是通過蜱蟲傳播寄生于動(dòng)物宿主紅細(xì)胞內(nèi)的原蟲,，它主要引起人和動(dòng)物的巴貝蟲病,，屬于人獸共染的寄生蟲病。人巴貝蟲病,，急性發(fā)病時(shí)頗似瘧疾,，臨床以間歇熱、脾大,、黃疸及溶血等為特征,。目前已經(jīng)有 100 種以上的巴貝斯蟲得到鑒定,，是人和動(dòng)物健康的重大威脅，因此快速檢測巴貝斯蟲具有重要的意義,。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測巴貝斯蟲的通用的試劑盒,。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，分析靈敏度高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng),。

3.提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高,，引物是根據(jù)巴貝斯屬通用 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì),，不會(huì)跟其他生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.In silico 分析發(fā)現(xiàn)本產(chǎn)品可以檢測 B. venatorum,、B. divergens,、B. capreoli 和 B.canis 等大巴貝斯，但不能檢測 B. microti,。

6.既用于定性檢測,，又用于定量檢測。定量檢測時(shí)線性范圍至少 5 個(gè)數(shù)量級(jí),。

7.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法熒光定量PCR 反應(yīng),。

8.巴貝斯屬通用探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒,，可滿足一定規(guī)模的檢測需求,。

檢測方法

實(shí)時(shí)熒光PCR，具有快速,、準(zhǔn)確,、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix,、熒光 PCR 專用模板稀釋液,、超純水、巴貝斯屬通用 qPCR 引物-探針干粉,、巴貝斯屬通用 qPCR 陽性對照(1E7 拷貝/μL),、使用手冊。

自備試劑

樣品 DNA,，超純水,，核酸純化試劑盒。

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸，-20℃保存,，保存期限為 24 個(gè)月,。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本

產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照,。

1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6,、5,、4、3,、2,、1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,，最好用帶芯槍頭,，下同）。

3.在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震蕩 1

分鐘,，得 1E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

4.換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

5.換槍頭,，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

二,、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性

對照）,，一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對照）,。可以用 10 μL 上步所得 4 號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC 另外用水作為 NC,。

8.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品 DNA -提取試劑盒兼容,。也可以選購本公司的核酸-提取試劑,。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于PCR 陰性對照（用水做模板）,，1 個(gè)用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號(hào)管的陽性對照稀釋液做模板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好

后最后加）：

成分樣品管

N+2 個(gè)PCR 陰性

對照標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

巴貝斯屬通用 qPCR

引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個(gè)待測 DNA 樣本各 7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液

（1-6 號(hào)）

不加

不加各 7 μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3

號(hào)樣到 3 號(hào)

管…）

四,、數(shù)據(jù)處理

12.如果樣本制備陽性對照或PCR 陽性對照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性,，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù),，需要重新樣本制備,，重新進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對照或 PCR 陰性對照結(jié)果為陽性,，說明環(huán)境污染,，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù),，需要跟廠家聯(lián)系,。

13.如果陰性對照和陽性對照均正常，則實(shí)驗(yàn)有效,，可以進(jìn)入后續(xù)分析,。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 40,，否則實(shí)驗(yàn)無效,。如果實(shí)驗(yàn)有效,，則分析待測樣品,，如果無 Ct 或 Ct 大于

或等于 40，則為陰性,。如果 Ct 小于 40 則為陽,。

選擇我們的巴貝斯屬通用探針法熒光PCR試劑盒，就是選擇精準(zhǔn),、高效,、可靠的檢測方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航,！