在臨床診斷與生命科學(xué)研究領(lǐng)域,，乳酸脫氫酶（LDH）檢測是一項(xiàng)具有價(jià)值的指標(biāo)。精準(zhǔn)規(guī)范的檢測操作流程,，是獲取可靠檢測數(shù)據(jù)的關(guān)鍵前提,。
血液是 LDH 檢測常見樣本類型。采集時(shí),，需采用干燥,、無添加劑的專用采血管，采血量一般控制在 3 - 5ml,。采血后,，應(yīng)輕輕顛倒采血管 8 - 10 次，確保血液與抗凝劑充分混勻,，防止血液凝固,。對(duì)于血清樣本，需在室溫下靜置 30 分鐘,，待血液凝固后再進(jìn)行離心,。離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為 3000rpm，持續(xù)離心 10 分鐘,，此參數(shù)是經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出的條件,，既能有效分離出血清,，又可避免細(xì)胞破損釋放過多 LDH 造成檢測結(jié)果偏高。離心后的血清應(yīng)盡快進(jìn)行檢測,，若不能及時(shí)檢測,，需放置于 2 - 8℃冰箱中保存，但保存時(shí)間不宜超過 24 小時(shí),。
LDH 檢測試劑盒在使用前需提前 30 分鐘從冰箱取出,，放置至室溫平衡。試劑平衡至室溫的過程,，猶如喚醒沉睡的檢測系統(tǒng),，各組分活性逐漸恢復(fù)至最佳狀態(tài)。加樣時(shí),，移液器需精準(zhǔn)校準(zhǔn),，誤差控制在 ±2% 以內(nèi)。吸取樣本時(shí),，移液器槍頭應(yīng)垂直插入樣本液面下 2 - 3mm 處,，避免產(chǎn)生氣泡。加樣量根據(jù)試劑盒說明書要求,，一般在 20 - 50μl 之間,。加樣動(dòng)作需輕柔而準(zhǔn)確，加樣后輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板,，使樣本與試劑充分混合,，但晃動(dòng)幅度不宜過大，以防液體濺出,。
當(dāng)樣本與試劑混合均勻后,，酶反應(yīng)即刻啟動(dòng)。LDH 在催化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,，將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸,，同時(shí)伴隨著 NAD+ 還原為 NADH。這個(gè)過程對(duì)溫度極為敏感,，37℃是最適反應(yīng)溫度,。實(shí)驗(yàn)室常用水浴孵箱或酶標(biāo)儀自帶孵育功能進(jìn)行溫控。孵育時(shí)間一般設(shè)定為 15 - 30 分鐘,，時(shí)間過短,，反應(yīng)不充分，吸光度值偏低,；時(shí)間過長,，可能導(dǎo)致反應(yīng)體系中底物耗盡，酶活性下降，同樣影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性,。
孵育完成后,，使用酶標(biāo)儀在 340nm 波長下讀取吸光度值。340nm 是 NADH 特征吸收峰,，吸光度值與樣本中 LDH 活性呈正相關(guān),。讀取時(shí)，酶標(biāo)儀需預(yù)熱 30 分鐘,，光路系統(tǒng)需保持清潔,，避免灰塵或液體殘留干擾光信號(hào)傳輸。結(jié)果分析時(shí),，依據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算,。標(biāo)準(zhǔn)曲線需定期重新繪制，以驗(yàn)證試劑盒性能穩(wěn)定性,。若檢測結(jié)果超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍,，需對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后重新檢測,。
每次檢測都應(yīng)同步檢測低,、中、高三個(gè)濃度的質(zhì)控品,。質(zhì)控品猶如檢測系統(tǒng)的 “標(biāo)尺",，其結(jié)果可反映整個(gè)檢測流程的準(zhǔn)確性與精密度。低濃度質(zhì)控品結(jié)果波動(dòng)范圍應(yīng)控制在 ±10% 以內(nèi),，中,、高濃度控制在 ±8% 以內(nèi)。若質(zhì)控結(jié)果偏離此范圍,，需立即排查問題,，可能是試劑配制錯(cuò)誤、儀器校準(zhǔn)偏差或操作步驟失誤等,。只有質(zhì)控合格的檢測結(jié)果,，才具有臨床參考價(jià)值。
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