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概述

活/死細(xì)胞雙染色試劑盒在細(xì)胞分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,，可精準(zhǔn)區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，助力細(xì)胞活性評(píng)估,、藥物篩選及細(xì)胞凋亡研究等,。其操作簡(jiǎn)便、靈敏度高,，結(jié)果可通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀直觀呈現(xiàn),。

前處理

細(xì)胞準(zhǔn)備

無(wú)論是懸浮細(xì)胞還是貼壁細(xì)胞，在進(jìn)行雙染色前需確保細(xì)胞狀態(tài)良好,，密度適宜,。細(xì)胞密度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響染色效果及后續(xù)檢測(cè)準(zhǔn)確性。懸浮細(xì)胞直接取適量細(xì)胞懸液,，用預(yù)冷的 PBS 洗滌 2 - 3 次,，離心去除培養(yǎng)基及雜質(zhì)。貼壁細(xì)胞則先用胰酶消化,，制成單細(xì)胞懸液,，再按上述方法洗滌。洗滌過(guò)程動(dòng)作輕柔,，避免細(xì)胞過(guò)度離心導(dǎo)致?lián)p傷,。

試劑準(zhǔn)備

活/死細(xì)胞雙染色試劑盒通常包含兩種熒光染料，一種用于標(biāo)記活細(xì)胞,，如綠色熒光染料 Calcein-AM,，另一種用于標(biāo)記死細(xì)胞，如紅色熒光染料 PI（碘化丙啶）,。使用前,，先檢查試劑是否在有效期內(nèi)，是否有變色,、沉淀等現(xiàn)象,。若有異常，不可使用,。取適量染料,，按試劑盒說(shuō)明書推薦的比例用無(wú)菌水或 PBS 稀釋，配制成工作液,。例如,，Calcein-AM 常用濃度為 1 - 10 μM,，PI 常用濃度為 1 - 20 μg/mL,。配制好的工作液應(yīng)立即使用,，避免長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致活性下降。

染色步驟

加入染色液

將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液與染色工作液按一定比例混合,，輕輕吹打混勻,，使染料均勻分布于細(xì)胞周圍。對(duì)于 96 孔板培養(yǎng)的細(xì)胞,，一般每孔加入 100 μL 染色工作液和 10 μL 細(xì)胞懸液,，確保細(xì)胞充分接觸染料。

孵育

置于 37℃,、5% CO?的培養(yǎng)箱中孵育 15 - 30 分鐘,。孵育時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則可能影響細(xì)胞活性,，導(dǎo)致染色結(jié)果偏差,。孵育過(guò)程中，細(xì)胞攝取染料并進(jìn)行代謝反應(yīng),。Calcein-AM 在活細(xì)胞內(nèi)經(jīng)酯酶作用轉(zhuǎn)化為具有熒光的 Calcein,，發(fā)出綠色熒光；PI 則能穿透死細(xì)胞破損的細(xì)胞膜,，與細(xì)胞核中的 DNA 結(jié)合,，發(fā)出紅色熒光。

觀察與記錄

熒光顯微鏡觀察

孵育結(jié)束后,，立即將染色后的細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察,。選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，Calcein-AM 的激發(fā)波長(zhǎng)為 490 - 515nm,，發(fā)射波長(zhǎng)為 515 - 530nm,；PI 的激發(fā)波長(zhǎng)為 535nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 617nm,。通過(guò)調(diào)整光強(qiáng)和焦距,，清晰看到綠色熒光標(biāo)記的活細(xì)胞和紅色熒光標(biāo)記的死細(xì)胞，可拍攝多張照片,，記錄細(xì)胞形態(tài)及分布情況,。

流式細(xì)胞儀分析

對(duì)于高通量、定量分析,，將染色后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè),。設(shè)置合適的熒光通道，收集至少 10?個(gè)細(xì)胞的信號(hào),，得到散點(diǎn)圖,，橫軸為 PI 熒光強(qiáng)度（代表死細(xì)胞），縱軸為 Calcein-AM 熒光強(qiáng)度（代表活細(xì)胞）。根據(jù)細(xì)胞在圖中的分布情況,，準(zhǔn)確計(jì)算活細(xì)胞和死細(xì)胞的比例,。

注意事項(xiàng)

操作環(huán)境

整個(gè)操作過(guò)程需在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，避免雜菌污染影響細(xì)胞狀態(tài)及染色結(jié)果,。使用無(wú)菌移液器,、離心管等器具，細(xì)胞培養(yǎng)箱,、超凈工作臺(tái)等設(shè)備定期清潔消毒,。

細(xì)胞處理

操作細(xì)胞時(shí)動(dòng)作輕柔，避免用力吹打或劇烈振蕩,，防止細(xì)胞受損,。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板準(zhǔn)確計(jì)數(shù),，確保細(xì)胞濃度符合實(shí)驗(yàn)要求,。

試劑使用

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，不同品牌,、型號(hào)的試劑盒組分和使用方法可能存在差異,。使用過(guò)程中，避免染料接觸皮膚和眼睛,，一旦接觸,，立即用大量清水沖洗。

后續(xù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,，妥善處理廢棄物,，如含染料的廢液、一次性耗材等,，避免對(duì)環(huán)境造成污染,。將未用完的試劑按說(shuō)明書要求保存，如 4℃避光保存,，以備下次使用,。