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在細(xì)胞生物學(xué)研究中,，細(xì)胞凋亡的檢測對于揭示細(xì)胞生理和病理機(jī)制至關(guān)重要,。Annexin V-EGFP/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒以其高靈敏度和特異性，為科研人員提供了一種可靠的細(xì)胞凋亡檢測方法,。

一,、試劑盒的組成與工作原理

Annexin V-EGFP/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒主要包含 Annexin V-EGFP 和碘化丙啶（PI）。Annexin V 是一種鈣離子依賴型磷脂結(jié)合蛋白,，能與磷脂酰絲氨酸（PS）高親和力特異性結(jié)合,。在細(xì)胞凋亡早期，PS 從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè),，Annexin V-EGFP 可標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞，發(fā)出綠色熒光,。PI 是一種核酸染料,，無法透過完整細(xì)胞膜,，但在晚期凋亡和死細(xì)胞中，PI 可進(jìn)入細(xì)胞與 DNA 結(jié)合發(fā)出紅色熒光,。二者結(jié)合使用,，可區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡及死細(xì)胞,。

二,、操作使用方法

染色前準(zhǔn)備

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：根據(jù)實(shí)驗要求培養(yǎng)細(xì)胞至適宜密度。貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化,，懸浮細(xì)胞直接收集,。

2. 細(xì)胞洗滌：用預(yù)冷 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，去除培養(yǎng)基成分,。300×g 離心 5 分鐘,，棄上清。

3. 細(xì)胞懸浮：用 Binding Buffer 懸浮細(xì)胞,，調(diào)整濃度至

   $1 \times 10^5 - 1 \times 10^6 \, \text{cells/mL}$

   ,。

染色過程

1. 取細(xì)胞懸液：取 100 μL 細(xì)胞懸液于離心管。

2. 加 Annexin V-EGFP：按說明書加適量 Annexin V-EGFP 染色液（一般 5 μL）,。

3. 加 PI 染色液：按說明書加適量 PI 染色液（一般 5 μL）,。

4. 混勻與孵育：輕輕吹打混勻，室溫避光孵育 15 - 30 分鐘,。

染色后處理

1. 洗滌去除未結(jié)合染料：用 Binding Buffer 洗滌細(xì)胞一次,，300×g 離心 5 分鐘，重懸細(xì)胞,。

2. 流式細(xì)胞儀分析：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀檢測管,，立即分析。Annexin V-EGFP 激發(fā)波長 488 nm,，發(fā)射波長 509 nm,；PI 激發(fā)波長 488 - 501 nm，發(fā)射波長 617 nm,。

三,、質(zhì)量控制與注意事項

質(zhì)量控制

試劑盒應(yīng)保存于 4℃，避免光照與溫度波動,。每批次經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)檢,，確保性能穩(wěn)定。試劑盒穩(wěn)定性好,，可在有效期內(nèi)使用,。

注意事項

1. 操作環(huán)境控制：實(shí)驗操作需在無菌環(huán)境進(jìn)行，防止細(xì)胞污染。避免物理,、化學(xué)刺激,，以免影響細(xì)胞凋亡狀態(tài)。

2. 染色時間優(yōu)化：根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗需求優(yōu)化染色時間,，防止染色不充分或非特異性染色,。

3. 避光操作：Annexin V-EGFP 和 PI 染料光敏，操作時減少樣本光照,，防熒光淬滅,。

4. 細(xì)胞狀態(tài)監(jiān)測：實(shí)驗全程觀察細(xì)胞狀態(tài)，確保良好生理狀態(tài),，異常時及時調(diào)整條件,。