引言

生物流體（如血液、尿液,、唾液等）中細(xì)菌的存在與人類生活和公共健康密切相關(guān),。在疾病初期及時(shí)、準(zhǔn)確鑒定致病菌種類對(duì)確認(rèn)致病菌感染源和阻止疾病傳播至關(guān)重要,。傳統(tǒng)細(xì)菌檢測(cè)方法有平板計(jì)數(shù)法,、酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISAs）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCRs）等,，這些技術(shù)雖然促進(jìn)了細(xì)菌檢測(cè)的發(fā)展,，但仍存在耗時(shí)長(zhǎng)、勞動(dòng)密集,、實(shí)驗(yàn)成本高等不足,。雙重酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)具備更低的活性位點(diǎn)，傳質(zhì)速度快,、反應(yīng)效率高等優(yōu)勢(shì),，近年來(lái)被越來(lái)越多的用于生物傳感檢測(cè)領(lǐng)域,。

近期，南京師范大學(xué)王琛教授課題組采用一步還原法制備了雙重酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)Au@POM 納米顆粒子,，實(shí)驗(yàn)采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為模型,，以可見(jiàn)光波段光譜吸收強(qiáng)度為依據(jù)，分析細(xì)菌代謝過(guò)程中葡萄糖濃度與細(xì)菌代謝速度關(guān)系,。實(shí)驗(yàn)證明,，Au@POM納米酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)在細(xì)菌含量為1-7.5 x 10⁷ CFU mL^-1呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為5 CFU mL^-1,。

結(jié)果分析

納米酶級(jí)聯(lián)催化的細(xì)菌檢測(cè)原理如圖1所示,，采用一步還原法制備Au@POM 納米顆粒，金屬氧酸鹽（POMs）為殼,、金納米粒子（AuNPs）為核,。金納米顆粒（AuNPs）具備葡萄糖氧化酶（GOx）活性，金屬氧酸鹽（POMs）具備過(guò)氧化物酶（HRP）活性,，制備的Au@POM 納米顆粒具備雙重酶活性,。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為模型，在細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中需要消耗葡萄糖能源,，理論上葡萄糖含量越高,，細(xì)菌含量越低，因此可將葡萄糖含量與細(xì)菌含量的線性關(guān)系作為細(xì)菌定量分析的可行性策略,。首先,，AuNPs的葡萄糖氧化酶活性將葡萄糖底物氧化為葡萄糖酸，并產(chǎn)生H₂O₂,，然后,，利用POMs的過(guò)氧化物酶活性，將3’,3’5’,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化為TMB⁺,形成強(qiáng)可見(jiàn)光吸收峰,。

圖1納米酶級(jí)聯(lián)催化的細(xì)菌檢測(cè)原理示意圖,。（A） 一步還原法制備Au@POM（B） 級(jí)聯(lián)催化Au@POM納米酶。（C） 細(xì)菌在代謝過(guò)程（D）細(xì)菌/無(wú)細(xì)菌生物體系中可見(jiàn)光吸收強(qiáng)度,。

圖2 (A) Au@POM 納米顆粒TEM圖像,，顆粒直徑15nm，Au核的POM薄層厚約1nm,；（B）SEM圖和EDS圖譜,；（C）納米顆粒ζ電位圖；（D）不同材料XRD圖,；（E）Au與Au@POM的可見(jiàn)光吸收譜,，介電常數(shù)改變導(dǎo)致Au@POM紅移

圖3 （A）不同體系可見(jiàn)光吸收光譜；（B）Au@POMs + Glu + TMB納米酶級(jí)聯(lián)催化體系可見(jiàn)光吸收譜峰與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系；（C）對(duì)葡萄糖濃度做Michaelis–Menten模型的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)測(cè)定（TMB濃度為1.2mM）,；（D）納米酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的雙倒數(shù)圖

實(shí)驗(yàn)時(shí)采用金黃色葡萄球菌作為模型,，隨著細(xì)菌含量增加，吸收峰強(qiáng)度明顯降低,，在濃度為10-1x10⁷ CFU mL^-1區(qū)間，細(xì)菌含量與吸收峰強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,，金黃色葡萄球菌檢測(cè)限為5 CFU mL^-1,。作者同步做大腸桿菌對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其吸光度強(qiáng)度隨細(xì)菌濃度變化趨勢(shì)與金黃色葡萄球菌相似,，結(jié)果表明Au@POMs納米酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)具有良好的普適性,。

圖4 （A）納米酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)細(xì)菌檢測(cè)原理示意圖；（B）不同尺寸金黃色葡萄球菌的暗場(chǎng)視野圖像（0,10,10²-10⁷ CFU·mL^-1）,；（C）加入不同含量細(xì)菌后的可見(jiàn)光吸收光譜圖,；（D）人體血清樣品和PBS緩沖液的細(xì)菌檢測(cè)

結(jié)論

本文采用一步還原法合成納米酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)Au@POMs納米顆粒，該體系制備的Au@POM 納米顆粒具備雙重酶活性,，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為模型,，采用暗場(chǎng)顯微鏡直接觀測(cè)細(xì)菌形貌，并通過(guò)不同細(xì)菌模型的可見(jiàn)光吸收光譜進(jìn)行細(xì)菌濃度的半定量分析,。結(jié)果表明,，細(xì)菌含量與可見(jiàn)光吸收強(qiáng)度具備良好的線性關(guān)系。將金黃色葡萄球菌摻入10%血清中,，結(jié)果與在PBS緩沖液中結(jié)果相似,，表明該方法在真實(shí)樣品檢測(cè)中具備潛在應(yīng)用，為高靈敏度實(shí)施細(xì)菌檢測(cè)提供了有力工具,。

南京師范大學(xué)王琛教授課題組簡(jiǎn)介

王琛,，南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師,，國(guó)家優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者（2020年）,，江蘇省“青藍(lán)工程"優(yōu)秀青年骨干教師、中青年學(xué)術(shù)帶頭人,；南京師范大學(xué)本科,、碩士，2011年博士畢業(yè)于南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生命分析國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,，2012-2016南京大學(xué)從事物理學(xué)博士后,，2016-2017年麻省理工學(xué)院（MIT，美國(guó)）訪問(wèn)學(xué)者,。至今,，在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等學(xué)術(shù)期刊發(fā)表研究論文60 余篇；參編英文圖書(shū) 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley)；主持多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金,、江蘇省重點(diǎn)研發(fā),、江蘇省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目；擔(dān)任Chinese Chemical Letters期刊編委,，中國(guó)分析測(cè)試協(xié)會(huì)青年學(xué)術(shù)委員會(huì)委員,，江蘇省材料學(xué)會(huì)副秘書(shū)長(zhǎng)。

文章信息

本文以“Nanozyme-catalyzed cascade reaction enables a highly sensitive detection of live bacteria"為題發(fā)表在Journal of Materials Chemistry B上,，中國(guó)藥科大學(xué)柳文媛教授和南京師范大學(xué)王琛教授為通訊作者,。

本研究暗場(chǎng)顯微圖像使用的是北京卓立漢光儀器有限公司RTS2 多功能激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，如需了解該產(chǎn)品,，歡迎咨詢,。

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