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 引言

      γH2AX 是染色體組蛋白H2A家族的成員之一,。在各種理化因素刺激下，細胞DNA雙鏈發(fā)生斷裂,，ATM,、ATR等磷脂酰肌醇3-激酶使H2AX上的第139位絲氨酸發(fā)生磷酸化修飾，形成磷酸化的γH2AX ,。γH2AX作為一種生物標(biāo)志物可以清楚地反映DNA損傷程度和修復(fù)情況, 被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于細胞凋亡研究中, 是細胞損傷應(yīng)激反應(yīng)的研究熱點之一,。常見的γH2AX鑒定分析方法包括免疫發(fā)光法和質(zhì)譜法,，但因復(fù)雜預(yù)處理過程會假陽性。因此原位實時檢測細胞核內(nèi)γH2AX對于準(zhǔn)確評估遺傳毒性至關(guān)重要,。SERS技術(shù)具備原位,、無損、預(yù)處理簡單,、高靈敏度等優(yōu)勢,，有望用于γH2AX原位分析。但是,，SERS檢測細胞核內(nèi)物質(zhì)仍面臨巨大挑戰(zhàn),。SERS增強效果與粗糙金屬尺寸相關(guān)，顆粒直徑越大,，振蕩頻率和增強效果越好,。進入細胞核內(nèi)需要穿過核孔，其限制直徑尺寸為10-30nm,，粗糙金屬顆粒尺寸小導(dǎo)致SERS增強效果弱,。在現(xiàn)有技術(shù)中，主要通過修改核定位序列實現(xiàn)主動運輸至細胞核來實現(xiàn)核內(nèi)檢測,，該技術(shù)提高了進核效率,，卻因基質(zhì)存在而產(chǎn)生背景干擾。

在本文中,，南京師范大學(xué)王琛教授課題組構(gòu)建了一種基于金納米粒子（GNPs）的小型免疫傳感器SERS探針,，成功檢測受限靶點γH2AX，評估藥物遺傳毒性,。作者利用γH2AX作為限制靶點的特性,，構(gòu)建了一種基于小尺寸（15nm）金納米探針的γH2AX免疫傳感器，并用TAT核靶向肽對其進行了修飾,，以確保高的核進入效率,。一旦DNA損傷被誘導(dǎo)，γH2AX的局部過表達通過免疫識別進一步募集探針,，從而可以原位組裝熱點,，將增強拉曼信號用于遺傳毒性檢測。本研究提出了一種研究提出了一種新的SERS檢測受限靶誘導(dǎo)的尺寸轉(zhuǎn)換和熱點形成的方法,，用于分析核內(nèi)遺傳毒性標(biāo)志物,。該技術(shù)的優(yōu)點在于簡化了SERS探針的結(jié)構(gòu)和操作過程，避免了對含有熱點的系統(tǒng)的額外設(shè)計,，從而減少了背景信號,，從而為在單個活細胞水平上原位實時檢測核內(nèi)靶標(biāo)提供了參考,。

結(jié)果分析

作者利用γH2AX作為限制靶點的特性,，構(gòu)建了一種基于小尺寸（15nm）金納米探針的γH2AX免疫傳感器,，探針以4-巰基芐腈（4-MBN）修飾的15nm GNPs為增強顆粒，PEG2000為穩(wěn)定鏈,，TAT為穿透肽,，γH2AX單克隆抗體為探測識別物，建立為抗-γH2AX@GPMT的SERS傳感器,。

實驗時通過TAT穿透肽的小顆粒和核靶向功能進入細胞核,，將構(gòu)建的SERS細胞傳感器與藥物一起孵育。若藥物沒有遺傳毒性探針以分散狀態(tài)分布,，拉曼信號弱,。相反，如果藥物具有遺傳毒性發(fā)生DNA損傷,，產(chǎn)生γH2AX的局部表達,，誘導(dǎo)探針進一步免疫識別和聚集，在原位構(gòu)建增強熱點,，產(chǎn)生高強度拉曼信號實現(xiàn)遺傳毒性鑒定,。

圖1 （A）抗-γH2AX@GPMT制備原理圖；（B） GNPs的ζ電勢圖,；（C）不同GNPs紫外-可見光譜圖,；（D）不同基質(zhì)拉曼光譜圖（1592cm^-1和2230 cm^-1是4-MBN特征峰）；（E）抗-γH2AX@GPMT的TEM圖像,；(F) anti-γH2AX@GPMT的EDX圖

圖2 （A）抗-γH2AX@GPMT的檢測策略.（B）TAT修飾不同尺寸SERS基底Au尺寸分布（C）15nm抗-γH2AX@GPMT在2230 cm^?1處的暗場,、明場和拉曼光譜圖（D）30 nm抗-γH2AX@GPMT在2230 cm^?1處的暗場、明場和拉曼光譜圖（E）MMS孵育前后SERS強度差值,。（F）抗-γH2AX@GPMT的MMS平均需求量

圖3 （A）γH2AX靶點體外模擬方案略.（B） γH2AX尺寸與PH值關(guān)系（C）加入抗-γH2AX@GPMT.后實物圖（D）不同PH值孵育環(huán)境下,，抗-γH2AX@GPMT的拉曼光譜。（E） 抗-γH2AX@GPMT在2230cm^-1拉曼強度與PH值關(guān)系,。（F） 不同濃度的γH2AX肽孵育的抗-γH2AX@GPMT的拉曼光譜圖（G）抗-γH2AX@GPMT在2230cm^-1拉曼強度與γH2AX肽濃度關(guān)系

圖4 抗-γH2AX@GPMT的靶誘導(dǎo)機制.（A）加入γH2AX肽前后抗-γH2AX@GPMT的TEM圖像（B） 抗γ的生物TEM圖像H2AX@GPMTγH2AX孵育前后,。（C）抗-γH2AX@GPMT拉曼光譜（D）抗-γH2AX@GPMT的2230 cm^?1拉曼光譜歸一化強度

圖5 SERS傳感器優(yōu)化和表征。（A）不同時間下細胞攝取抗-γH2AX@GPMT顯微圖像（B） 加入GNP和抗-γH2AX@GPMT后L02細胞活性（C）不同傳感器的CYP450代謝酶活性,。

圖6（A）藥物遺傳毒性評價方案,。（B） 在不同時間MMS孵育時間細胞暗場、明場和拉曼Mapping圖（2230 cm^?1峰位）,。黃色實線區(qū)域為拉曼采集區(qū),。黃色虛線圓圈表示細胞核區(qū)域（C）在不同時間MMS孵育時間細胞暗場、明場和拉曼Mapping圖（2230 cm^?1峰位）,。（D） 不同孵育時間下2230 cm^?1的拉曼平均強度

結(jié)論

本研究以γH2AX為細胞核內(nèi)定向靶點,，突破了SERS探針進入細胞核效率和信號增強因子之間的局限性。構(gòu)建了一種基于GNP探針的γH2AX免疫傳感器來評估藥物遺傳毒性。該傳感器具備TAT膜穿透性和核靶向功能,，使小顆粒探針能夠穿過核孔并成功進入細胞核,。該探針進入細胞核內(nèi)后，GTIs誘導(dǎo)DNA損傷和γH2AX局部過表達,，導(dǎo)致原位構(gòu)建增強熱點并產(chǎn)生強拉曼信號,，進一步增強了探針的免疫識別性能，解決了小探針增強性能差和大探針入核效率差的矛盾難題,。本文所設(shè)計SERS探針可原位分析細胞核內(nèi)遺傳毒性,，為藥物遺傳毒性篩選提供了一種新方法，也為細胞核內(nèi)原位實時檢測提供了實驗靈感,。

南京師范大學(xué)王琛教授課題組簡介

王琛,，南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師,，國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者（2020年）,，江蘇省“青藍工程"優(yōu)秀青年骨干教師、中青年學(xué)術(shù)帶頭人,；南京師范大學(xué)本科,、碩士，2011年博士畢業(yè)于南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生命分析國家重點實驗室,，2012-2016南京大學(xué)從事物理學(xué)博士后,，2016-2017年麻省理工學(xué)院（MIT，美國）訪問學(xué)者,。至今,，在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等學(xué)術(shù)期刊發(fā)表研究論文60 余篇；參編英文圖書 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley),；主持多項國家自然科學(xué)基金,、江蘇省重點研發(fā)、江蘇省自然科學(xué)基金等項目,；擔(dān)任Chinese Chemical Letters期刊編委,，中國分析測試協(xié)會青年學(xué)術(shù)委員會委員，江蘇省材料學(xué)會副秘書長,。

文章信息

本文以“Confined Target-Triggered Hot Spots for In Situ SERS Analysis of Intranuclear Genotoxic Markers"為題發(fā)表在Analytical Chemistry上,，中國藥科大學(xué)韓凌飛為第一作者，南京師范大學(xué)王琛教授和中國藥科大學(xué)柳文媛教授為通訊作者,。

本研究采用的是北京卓立漢光儀器有限公司RTS2 多功能激光共聚焦顯微拉曼光譜儀,，如需了解該產(chǎn)品，歡迎咨詢,。

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