諾博萊德 Tuner(DE3)感受態(tài)細(xì)胞

Tuner(DE3)感受態(tài)細(xì)胞   載體構(gòu)建

產(chǎn)品貨號(hào)：C9938

產(chǎn)品名稱(chēng)：Tuner(DE3)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格：10×100μl

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：-70℃

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderC9938 Tuner(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為 LacYZ 突變型 BL21(DE3)菌株。Tuner(DE3)菌株可利用 IPTG 的加入量來(lái)精準(zhǔn)地控制重組蛋白的表達(dá)量,，與pET 系列載體聯(lián)合使用,，可以使得蛋白表達(dá)從低表達(dá)水平到高表達(dá)水平進(jìn)行有效調(diào)控（使用低濃度的IPTG 誘導(dǎo)重組蛋白低水平表達(dá)時(shí),，目的蛋白可能會(huì)具有更好的可溶性和生物活性）。該菌株含有λ噬菌體DE3區(qū),，可以表達(dá)T7RNA 聚合酶,。Tuner(DE3)菌株屬于B菌株，lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型,。Tuner(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制成,，pUC19 質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)107cfu/μgDNA。

基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-) gal dcmlacY1 (DE3)

菌株抗性：對(duì)氨芐青mei素,、卡那mei素,、氯mei素和四環(huán)素敏感,。

操作方法：（以下操作均按無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）

（以氨芐青mei素抗性的 pET 質(zhì)粒為例）

1. 將感受態(tài)細(xì)胞置于冰水浴中化凍。待細(xì)胞剛化凍后,，加入1-5μL含有1-100ng的質(zhì)粒DNA 到細(xì)胞中,，用手指bo打管底，輕輕混勻,。

2. 冰水浴中放置30分鐘，不要晃動(dòng),。

3. 42℃熱擊60秒鐘,，不要晃動(dòng)。

4. 冰水浴中放置2分鐘,，不要晃動(dòng),。

5. 加入500μL的室溫的SOC或LB培養(yǎng)基。

6. 置于37℃搖床中,，150-200rpm,，復(fù)蘇培養(yǎng)60分鐘。

7. 取50-100μL 菌液涂布在含有氨芐青mei素抗性的LB平板上,。待液體吸干后,，倒置平板37℃培養(yǎng)12-24 小時(shí),。

（平板劃線分離法：復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)束后,，12000rpm 離心30秒鐘，棄掉上清,，留100μL左右的液體,，用200μL 吸頭輕輕吹打散菌塊， 取10μL重懸的菌液分多點(diǎn)滴在平板上,，傾斜吸頭,，用吸頭頭部的側(cè)面將滴在平板上的液體來(lái)回劃線。這個(gè)方法可以獲得更大的單克隆菌落）,。

注意事項(xiàng)：

1．感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃,，不可反復(fù)凍融，否則其轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低,。

2．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作,，防止其它DNA或雜菌的污染，避免為以后的篩選,、鑒定帶來(lái)影響,。

3．轉(zhuǎn)化時(shí)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,，但當(dāng)加入的外源DNA量過(guò)多或體積過(guò)大反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率,。轉(zhuǎn)化時(shí)DNA體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一,。

4．轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量。

5．為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功,，可以保留部分連接產(chǎn)物,，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到*低,。

Tuner(DE3)感受態(tài)細(xì)胞   載體構(gòu)建

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C9938 Tuner(DE3)感受態(tài)細(xì)胞  10×100μl