諾博萊德 dam-/dcm-感受態(tài)細(xì)胞

dam-/dcm-感受態(tài)細(xì)胞   載體構(gòu)建

產(chǎn)品貨號(hào)：C9108

產(chǎn)品名稱(chēng)：dam-/dcm-感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格：20*100ul

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：-70℃

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderC9108 dam-/dcm-感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌dam-/dcm-菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細(xì)胞,。dam-/dcm-菌株來(lái)源于大腸桿菌K12菌株,，該菌株為dam和dcm甲基化酶失活突變型菌株,，常用于質(zhì)粒DNA的去dam和dcm甲基化處理,，消除dam和dcm甲基化對(duì)酶切的影響,。核酸內(nèi)切酶 (endA1)基因的缺失有利于提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量,。甲基化酶的失活突變可能會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒DNA在該菌株中會(huì)出現(xiàn)突變,，不建議連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),，僅用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。菌株還具有抗T1 噬菌體感染的特點(diǎn)。pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>×106cfu/μgDNA,。

基因型：ara-14 leuB6 fhuA31 lacY1 tsx78 glnV44 galK2 galT22mcrA dcm-6 hisG4 rfbD1 R(zgb210::Tn10)TetS endA1 rspL136 (StrR)dam13::Tn9 (CamR) xylA-5 mtl-1 thi-1 mcrB1 hsdR2

菌株抗性: 對(duì)氯mei素,、鏈mei素有抗性；對(duì)氨芐青mei素,、卡那mei素,、壯觀mei素和四環(huán)素敏感。

操作方法：（以下操作均按無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）

1. 將感受態(tài)細(xì)胞置于冰水浴中化凍,。待細(xì)胞剛化凍后,，加入1-5μL含有1-100ng的質(zhì)粒DNA到細(xì)胞中，用手指bo打管底,，輕輕混勻,。

2. 冰水浴中靜置30分鐘。

3. 42℃熱擊60秒鐘,，不要晃動(dòng),。

4. 冰水浴中靜置2分鐘。

5. 加入500μL 的室溫SOC或LB培養(yǎng)基,。

6. 置于37℃搖床中,，150-200rpm震蕩復(fù)蘇培養(yǎng)60分鐘。

7. 取50-100μL 菌液涂布在含有抗性的LB平板上,。待液體吸干后,，倒置平板，37℃培養(yǎng) 12-18 小時(shí),。

（平板劃線分離法：復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)束后,，12000rpm 離心30秒鐘，棄掉上清,，留100μL左右的液體,，用200μL 吸頭輕輕吹打散菌塊，取10μL重懸的菌液分多點(diǎn)滴在平板上,，傾斜吸頭,，用吸頭頭部的側(cè)面將滴在平板上的液 體來(lái)回劃線。這個(gè)方法可以獲得更大的單克隆菌落,。此方法主要適用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化最好用涂布法。）

（質(zhì)?？焖俎D(zhuǎn)化步驟：將步驟2的時(shí)間縮短到5分鐘,，對(duì)于氨芐青mei素抗性的質(zhì)粒，步驟4完成后,，可直接涂布或劃線于含氨芐青mei素抗性的LB平板上,。其它抗性的質(zhì)粒仍需60分鐘的復(fù)蘇培養(yǎng),。）

注意事項(xiàng)：

1．感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃，不可反復(fù)凍融,，否則其轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低,。

2．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止其它DNA或雜菌的污染,，避免為以后的篩選,、鑒定帶來(lái)影響。

3．轉(zhuǎn)化時(shí),，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,，但當(dāng)加入的外源DNA量過(guò)多或體積過(guò)大反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)DNA體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一,。

4．轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量。

5．為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功,，可以保留部分連接產(chǎn)物,，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到*低,。

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C9108 dam-/dcm-感受態(tài)細(xì)胞  20*100ul