諾博萊德  OverExpressC43(DE3)感受態(tài)細(xì)胞

OverExpressC43(DE3)感受態(tài)細(xì)胞 載體構(gòu)建

產(chǎn)品貨號(hào)：C9928

產(chǎn)品名稱：OverExpressC43(DE3)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格：10*100ul

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：-70℃

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderC9928  OverExpressC43(DE3)感受態(tài)細(xì)胞適用于毒性蛋白的表達(dá),，來源于 OverExpressC41(DE3)菌株,。OverExpress C41(DE3)是通過毒性蛋白在BL21(DE3)內(nèi)過表達(dá)篩選實(shí)驗(yàn)得到的基因突變菌株,該菌株的基因突變降低了T7RNA聚合酶的酶活性,，下調(diào)毒性蛋白的表達(dá)量使細(xì)胞存活。OverExpressC43(DE3)菌株是通過另一個(gè)毒性蛋白對(duì)OverExpress C41(DE3)菌株再次進(jìn)行毒性耐受性實(shí)驗(yàn)獲得的，OverExpress C43(DE3)菌株比 OverExpress C41(DE3)更加耐受毒性蛋白,。OverExpress C43(DE3)菌株也可以表達(dá)常規(guī)蛋白,，相同條件 下，蛋白表達(dá)量略低于BL21(DE3)菌株,。OverExpressC43(DE3)菌株屬于B菌株,，lon和ompT蛋白酶缺陷型。OverExpressC43(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制成,，pUC19 質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×107cfu/μgDNA,。

基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3)

菌株抗性：對(duì)氨芐青mei素，卡那mei素,，氯mei素和四環(huán)素敏感,。

操作方法：（以下操作均按無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）

（以氨芐青mei素抗性的 pET 質(zhì)粒為例）

1. 將感受態(tài)細(xì)胞置于冰水浴中化凍。待細(xì)胞剛化凍后,，加入1-5μl 含有1-100ng的質(zhì)粒DNA 到細(xì)胞中,，用手指bo打管底，輕輕混勻,。

2. 冰水浴中放置30分鐘,，不要晃動(dòng)。

3. 42℃熱擊60 秒鐘,，不要晃動(dòng),。

4. 冰水浴中放置 2 分鐘，不要晃動(dòng),。

5. 加入500μL的室溫的SOC或LB培養(yǎng)基,。

6. 置于 37℃搖床中，150-200rpm,，復(fù)蘇培養(yǎng)60分鐘,。

7. 取50-100μL 菌液涂布在含有氨芐青mie素抗性的 LB 平板上。待液體吸干后,，倒置平板 37℃培養(yǎng)12-24 小時(shí),。

（平板劃線分離法：復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)束后，12000rpm 離心30秒鐘,，棄掉上清,，留 100μL左右的液體，用200μL 吸頭輕輕吹打散菌塊,， 取10μL重懸的菌液分多點(diǎn)滴在平板上,，傾斜吸頭，用吸頭頭部的側(cè)面將滴在平板上的液體來回劃線,。這個(gè)方法可以獲得更多更大的單克隆菌落,。）

注意事項(xiàng)：

1,、感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃，不可反復(fù)凍融,，否則其轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低,。

2、實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格無菌操作,，防止其它DNA或雜菌的污染,，避免為以后的篩選,、鑒定帶來影響,。

3、轉(zhuǎn)化時(shí),，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,，但當(dāng)加入的外源DNA量過多或體積過大反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)DNA體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一,。

4,、轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量。

5,、為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功,，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉(zhuǎn)化,，將損失降到*低,。

OverExpressC43(DE3)感受態(tài)細(xì)胞 載體構(gòu)建

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C9928  OverExpressC43(DE3)感受態(tài)細(xì)胞  10*100ul