諾博萊德  T7pLysY感受態(tài)細(xì)胞

T7pLysY感受態(tài)細(xì)胞   載體構(gòu)建 

產(chǎn)品貨號(hào)：C9148

產(chǎn)品名稱：T7pLysY感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格：10*100ul

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：-70℃

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderC9148  T7pLysY感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌BL21增強(qiáng)型菌株,，為L(zhǎng)on和OmpT蛋白酶缺陷型，用于毒性或非毒性蛋白的表達(dá),。該菌株區(qū)別于BL21(DE3)pLysS和BL21(DE3)pLysE菌株的優(yōu)勢(shì)在于T7RNA聚合酶基因整合在細(xì)菌染色體上的lac操縱子區(qū)域，基因組中無(wú)λ前噬菌體序列,，LysY 表達(dá)的T7溶jun酶保留了對(duì)T7RNA 聚合酶的抑制作用但缺失了水解細(xì)胞壁的酰胺酶活性,，有利于降低基因的背景表達(dá)和避免誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)菌的裂解，菌株具有抗T1噬菌體感染等特點(diǎn),。T7pLysY 表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率大于108cfu/μg

基因型:

fhuA2lacZ::T7gene1[lon]ompTgalsulA11R(mcr-73::miniTn10--TetS )2[dcm]R(zgb-210::Tn10--TetS )endA 1D(mcr C-mrr)114::IS10 lysY (CamR)

菌株抗性：對(duì)氨芐青mei素，壯觀mei素,，卡na霉素,，鏈mei素和四環(huán)素敏感，對(duì)氯mei素有抗性,。

操作方法：（以下操作均按無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）

1. 將感受態(tài)細(xì)胞置于冰水浴中化凍,。待細(xì)胞剛化凍后，加入質(zhì)粒DNA 到細(xì)胞中,，用手指bo打管底,，輕輕混勻；

2. 冰水浴中靜置15-30分鐘,；

3. 42℃熱擊60秒鐘,，不要晃動(dòng)；

4. 冰水浴中靜置2分鐘,；

5. 加入500μL無(wú)菌的SOC或LB培養(yǎng)基,；

6. 置于37℃搖床中，150-200rpm震蕩復(fù)蘇培養(yǎng)60分鐘,；

7. 取50-100μL 菌液涂布在含34µg/ml氯mie素及所選質(zhì)粒篩選抗生素的LB平板上,。待液體吸干后，倒置平板,，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí),。

（平板劃線分離法：復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)束后，12000rpm 離心30秒鐘,，棄掉上清,，留100μL左右的液體,，用200μL吸頭輕輕吹打散菌塊，取10μL重懸的菌液分多點(diǎn)滴在抗性LB平板上,，傾斜吸頭,，用吸頭頭部的側(cè)面將滴在平板上的液體來(lái)回劃線。37℃培養(yǎng)過(guò)夜,。這個(gè)方法可以獲得更多更大的單克隆菌落,。）

注意事項(xiàng)：

1．感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃，不可反復(fù)凍融,，否則其轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低,。

2．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止其它DNA或雜菌的污染,，避免為以后的篩選,、鑒定帶來(lái)影響。

3．轉(zhuǎn)化時(shí),，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,，但當(dāng)加入的外源DNA量過(guò)多或體積過(guò)大反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)DNA體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一,。

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C9148  T7pLysY感受態(tài)細(xì)胞  10*100ul