NobleRyder 質(zhì)粒大量提取試劑盒 Plasmid Extraction Maxi Kit

質(zhì)粒大量提取試劑盒 質(zhì)粒提取 -常備現(xiàn)貨

產(chǎn)品貨號(hào)：D9998

產(chǎn)品名稱：質(zhì)粒大量提取試劑盒 Plasmid Extraction Maxi Kit

英文名稱：Plasmid Extraction Maxi Kit

產(chǎn)品規(guī)格：10T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：酶附件-20℃，其它試劑RT,，復(fù)檢期1年

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

  NobleRyder  D9998  質(zhì)粒大量提取試劑盒適用于本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞,，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。 離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效,、專一地吸附DNA,，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物，一般從50-100ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中,，可快速提取200-300μg高純度高拷貝的質(zhì)粒DNA,，提取率達(dá)85-90%。 使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作,，包括酶切,、PCR、測(cè)序,、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn),。

使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無水yi醇，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽,。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入）,，混勻，置于 2-8℃保存,。如非指明,，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

操作步驟（僅供參考）:

1. 取 50-100mL 細(xì)菌培養(yǎng)物,，11000rpm 離心 10min,，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。

2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入5mL溶液Ⅰ(請(qǐng)先檢查是否已加入RNase A）,，使用移液器或旋渦振蕩器che底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀,。注意：如果菌塊未che底混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低,。

3. 向離心管中加入5mL溶液Ⅱ,，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細(xì)菌基因組 DNA,，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠,，作用時(shí)間不要超過 5min，以免質(zhì)粒受到破壞,。

4. 向離心管中加入7mL溶液Ⅲ,，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻,，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀,，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀(如菌液過多，可在此步放置5分鐘,，以盡可能的降解RNA),。11000rpm 離心 10 分鐘，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中,，注意盡量不要吸出沉淀,。注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀,。如果上清中仍有少量絮狀沉淀,，可再次離心取上清。

5. 取上一步上清,，加入0.5倍體積無水乙醇,，充分混勻。（體積過多可分兩次混合,，然后上柱）

6. 將上一步所得混合液加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中),，室溫放置2-3min，11000rpm離心30-60s,，倒掉收集管中的廢液,，將吸附柱重新放回收集管中(如果為了提高得率，可將收集管中的液體加入吸附柱再次吸附一次),。

7. 向吸附柱中加入8mL漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇),，11000rpm離心2min，棄廢液,，將吸附柱放入收集管中,。

8. 向吸附柱中加入6mL漂洗液,，11000rpm離心2min,，棄廢液，將吸附柱放入收集管中,。

9. 11000rpm 離心 5min,，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn),，如酶切,、PCR等。

10. 將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中,，向吸附膜中央懸空滴加1-2mL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液,，室溫放置5min，11000rpm離心2min,。

11. 為了增加質(zhì)粒的回收效率,，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 5min,，11000rpm 離心2min,。

注意事項(xiàng)：

1. 使用前請(qǐng)先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象,，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘,，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。溶液Ⅱ,、溶液Ⅲ,、漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。

2. 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于500μL,，體積過小影響回收效率,；洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍),，pH 值低于7.0會(huì)降低洗脫效率,，DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解,。

3. 如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?10kb 的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量,，使用 100-200mL過夜培養(yǎng)物,，同時(shí)按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量,，吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)時(shí)間,，以增加提取效率。

4. DNA 濃度及純度檢測(cè)：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時(shí)間,、操作過程中的剪切力等因素有關(guān),。得到的 DNA 可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。DNA 應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰,，OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/mL雙鏈DNA,、40ug/mL單鏈DNA,。OD260/OD280比值應(yīng)為 1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液,，而使用去離子水,，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響吸光值,，但并不表示純度低,。

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