諾博萊德 Western及IP細(xì)胞裂解液無抑制劑

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白，如Triton,、SDS,、NP-40等，Western及IP細(xì)胞裂解液是采用一種非變性裂解方法來裂解細(xì)胞,，并獲得總蛋白的裂解液,。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于PAGE電泳，Western,，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等,，主要由Tris-HCl、NaCl,、低濃度Triton X-100,， 低濃度sodium pyrophosphate等組成，不含蛋白酶,、磷酸酶抑制劑,，并維持原有的蛋白間相互作用。

用Western及IP細(xì)胞裂解液(無抑制劑)(Cell lysis buffer for Western and IP without inhibitors)得到的蛋白,，可以用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度,。由于含有較高濃度的Triton X-100等干擾物質(zhì)，不宜用Bradford法測(cè)定由Western及IP細(xì)胞裂解液獲得樣本的蛋白濃度,。

產(chǎn)品組成：

諾博萊德 Western及IP細(xì)胞裂解液無抑制劑

操作步驟(僅供參考)：

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

取Western及IP細(xì)胞裂解液室溫溶解混勻,，根據(jù)需要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑。

去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液,，用PBS,、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次，低速離心,，棄上清,，留取沉淀。

按照6孔板每孔加入100～200μl裂解液的比例,，加入Western及IP細(xì)胞裂解液,。移液器輕輕吹打,，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液作用于細(xì)胞1～5s內(nèi),，細(xì)胞就會(huì)被裂解,。

10000～12000g,，離心3～5min(如果用冷凍離心機(jī)4℃離心效果更佳),，取上清。

進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE,、Western,、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1,、 取Western及IP細(xì)胞裂解液室溫溶解混勻,，根據(jù)需要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑。

2,、 低速離心懸浮細(xì)胞,，棄上清，收集沉淀,。

3,、 用手指輕彈細(xì)胞，使其松散,。按照6孔板每孔細(xì)胞加入100～200μl裂解液的比例,，加入Western及IP細(xì)胞裂解液。通常6孔板每孔細(xì)胞加入100μl裂解液已經(jīng)足夠,，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150～200μl,，再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀,。

4,、 10000～12000g，4℃離心3～5min(如無低溫離心機(jī),，室溫下離心亦可),，取上清。

5,、 進(jìn)行后續(xù)的PAGE,、Western、免疫沉淀等操作,。

(三)組織樣本

1,、 取Western及IP細(xì)胞裂解液置于室溫溶解混勻，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑,。

2,、 把組zhi剪切成細(xì)小的碎片,，越小越好。

3,、 取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織,，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控制在1～2min之內(nèi),，以減少蛋白的降解,。

4、 按照每20mg組織加入100～200μl裂解液的比例,，加入含有PMSF的裂解液,。冰上或4℃裂解30～60min。

5,、 步驟3,、4亦可以采用如下過程：按照每20mg組織加入100～200μl裂解液的比例加入Western及IP細(xì)胞裂解液。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,，直至充分裂解,，過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解,。

6,、 按照每20mg組織加入100～200μl裂解液的比例，加入Western及IP細(xì)胞裂解液,。

7,、 10000～12000g，4℃離心10～15min(如無低溫離心機(jī),，室溫下離心亦可),，取上清。

8,、 進(jìn)行后續(xù)的PAGE,、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

注意事項(xiàng)：

1.去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液時(shí),，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗,。

2.如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量,，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量,。

3.如果細(xì)胞量較多,，必需分裝成50～100萬細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分,，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸,，相對(duì)比較容易裂解充分。

4.如果組織樣品本身非常細(xì)小,，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解,，通過強(qiáng)烈Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清,，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器,，缺點(diǎn)是不如使用勻漿5.器那樣裂解得比較充分,。

6.溶解NobleRyder Cell lysis buffer for Western and IP時(shí)，應(yīng)盡量縮短溶解時(shí)間,，避免裂解液中的有效成分失效。

7.細(xì)胞裂解的操作步驟,，應(yīng)置于冰上或4℃進(jìn)行,。

有效期： 12個(gè)月有效。