諾博萊德 Western及IP細胞裂解液 樣本裂解

產(chǎn)品簡介：

多種成分均可以從細胞中提取總蛋白,，如Triton,、SDS、NP-40等,。Western及IP細胞裂解液是采用一種非變性裂解方法來裂解細胞,，并獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于PAGE電泳,，Western,，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl,、NaCl,、低濃度Triton X-100， 低濃度sodium pyrophosphate等組成,，并含有多種蛋白酶抑制劑成分,，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用,。

用NobleRyder Western及IP細胞裂解液得到的蛋白,，可以用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。由于含有較高濃度的Triton X-100等干擾物質(zhì)，不宜用Bradford法測定由Western及IP細胞裂解液獲得樣本的蛋白濃度,。

產(chǎn)品組成：

諾博萊德 Western及IP細胞裂解液 樣本裂解

操作步驟(僅供參考)：

(一)貼壁培養(yǎng)細胞

取Western及IP細胞裂解液置于室溫溶解混勻,，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM,。

去除貼壁細胞的培養(yǎng)液,，用PBS、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次,，低速離心,，棄上清，留取沉淀,。

按照6孔板每孔加入100～200μl含有PMSF的裂解液的比例,，加入Western及IP細胞裂解液。移液器輕輕吹打,，使裂解液和細胞充分接觸,。通常裂解液作用于細胞1～5s內(nèi)，細胞就會被裂解,。

10000～12000g,，離心3～5min(如果用冷凍離心機4℃離心效果更佳)，取上清,。

進行后續(xù)的SDS-PAGE,、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

(二)懸浮培養(yǎng)細胞

取Western及IP細胞裂解液置于室溫溶解混勻,，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM,。

低速離心懸浮細胞,，棄上清，收集沉淀,。

用手指輕彈細胞,，使其松散。按照6孔板每孔細胞加入100～200μl含有PMSF的裂解液的比例,，加入Western及IP細胞裂解液,。通常6孔板每孔細胞加入100μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到150～200μl,，再用手指輕彈以充分裂解細胞,。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。

10000～12000g,，4℃離心3～5min(如無低溫離心機,，室溫下離心亦可)，取上清。

進行后續(xù)的PAGE,、Western,、免疫沉淀等操作。

(三)組織樣本

取Western及IP細胞裂解液置于室溫溶解混勻,，加入PMSF,，使PMSF終濃度為1mM。

把組zhi剪切成細小的碎片,，越小越好,。

取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織，迅速用液氮研磨,，研磨過程盡量控制在1～2min之內(nèi),，以減少蛋白的降解。

按照每20mg組織加入100～200μl裂解液的比例,，加入含有PMSF的裂解液,。冰上或4℃裂解30～60min。

步驟3,、4亦可以采用如下過程：按照每20mg組織加入100～200μl裂解液的比例加入含有PMSF的Western及IP細胞裂解液,。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解,，過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解,。

按照每20mg組織加入100～200μl裂解液的比例,，加入含有PMSF的裂解液。

10000～12000g,，4℃離心10～15min(如無低溫離心機,，室溫下離心亦可)，取上清,。

進行后續(xù)的PAGE,、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

注意事項：

1.去除貼壁細胞的培養(yǎng)液時,，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗,。

2.如果裂解不充分可以適當增加裂解液的用量,，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量,。

3.如果細胞量較多,，必需分裝成50～100萬細胞/離心管，然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分,，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸,，相對比較容易裂解充分。

4.如果組織樣品本身非常細小,，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解,，通過強烈Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清,，用于后續(xù)實驗,。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器,，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分,。

5.溶解NobleRyder Cell lysis buffer for Western and IP時，應(yīng)盡量縮短溶解時間,，避免裂解液中的有效成分失效,。

6.細胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或4℃進行,。

有效期： 12個月有效,。