諾博萊德 NP-40裂解液 樣本裂解采集與制備

產(chǎn)品簡介：

多種成分均可以從細胞中提取總蛋白,，如 Triton、SDS,、NP-40 等,。NP-40 裂解液(NP-40 Lysis Buffer)是采用一種溫和的裂解方法獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于 PAGE 電泳,、 Western,、免疫沉淀(Immunol Precipitation ， IP)和免疫共沉淀(co-IP)等,，并含有多種蛋白酶抑制劑成分,，可有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用,。

NobleRyder NP-40 Lysis Buffer 主要由 Tris-HCl,、NaCl、NP-40 以及 sodium pyropho-sphate,，β-glycerophosphate,，sodium  fluoride,  EDTA 等多種蛋白酶抑制劑組成。用NP-40  Lysis  Buffer 得到的蛋白,，可以用 BCA 蛋白定量試劑盒和 Bradford 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,。 

產(chǎn)品組成：

諾博萊德 NP-40裂解液 樣本裂解采集與制備

操作步驟(僅供參考)：

(一)貼壁培養(yǎng)細胞

1、取 NP-40 Lysis Buffer  置于室溫溶解混勻,，加入 PMSF,，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2,、去除貼壁細胞的培養(yǎng)液,，用 PBS、NS 或無血清培養(yǎng)液清洗 1 次,，低速離心,，棄上清，留取沉淀,。

3,、按照 6 孔板每孔加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 NP-40  Lysis Buffer,。移液器輕輕吹打,，使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上或 4℃裂解 15～30min,，通常裂解液作用于細胞 1～3s內(nèi),，細胞就會被裂解,。

4、10000～12000g,，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機,，室溫下離心亦可)，取上清,。

5,、進行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western,、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

(二)懸浮培養(yǎng)細胞

1、取 NP-40  Lysis  Buffer  置于室溫溶解混勻,，加入 PMSF,，使 PMSF 終濃度為 1mM。低速離心懸浮細胞,，棄上清,，收集沉淀,。

2,、用手指輕彈細胞，使其松散,。按照 6 孔板每孔細胞加入 150～200μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,，加入 NP-40 Lysis Buffer  。通常 6 孔板每孔細胞加入 150μl 裂解液已經(jīng)足夠,，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到 200～250μl,。再用手指輕彈以充分裂解細胞，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀,。

3,、10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機,，室溫下離心亦可),，取上清。

4,、進行后續(xù)的 SDS-PAGE,、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

(三)組織樣本

1,、取 NP-40  Lysis  Buffer  置于室溫溶解混勻，加入 PMSF,，使 PMSF 終濃度為 1mm,。把組zhi剪切成細小的碎片，越小越好。

  2,、取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織,，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控

制在 1～2min 之內(nèi),，以減少蛋白的降解,。

3、按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的裂解液,。冰上或 4℃裂解 30～60min,。

4、 步驟 3,、4 亦可以采用如下過程：按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例,，加入含有 PMSF 的 NP-40 Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,，直至充分裂解,，該過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解,。

  5,、10000～12000g，4℃離心 5～15min(如無低溫離心機,，室溫下離心亦可),，取上清。

  6,、進行后續(xù)的 PAGE,、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

注意事項：

1,、在貼壁培養(yǎng)細胞的操作步驟中，去除貼壁細胞的培養(yǎng)液后,，如果血清中的蛋白沒有干擾,，可以不用清洗。

2,、如果裂解不充分可以適當增加裂解液的用量,，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量,。

3,、在培養(yǎng)細胞的裂解中，如果細胞量較多,，必需分裝成 50～100 萬細胞/離心管,，然后再裂解,。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸,，相對比較容易裂解充分,。

4、 如果組織樣品本身非常細小,，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解,，通過強烈 Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清,，用于后續(xù)實驗,。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器,，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分,。

  5、溶解 NobleRyder NP-40 Lysis Buffer 時,，應(yīng)盡量縮短溶解時間,，避免裂解液中的有效成分失效。

6,、細胞裂解的操作步驟,，應(yīng)置于冰上或 4℃進行。

7,、為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。

有效期：12個月有效,。