諾博萊德 RIPA裂解液(弱) 樣本裂解采集

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

多種成分均可從細(xì)胞中提取總蛋白，如Triton,、SDS,、NP-40等。RIPA裂解液(弱) (Weak RIPA Lysis Buffer )是采用一種溫和的裂解方法獲得總蛋白的裂解液,。所獲得的蛋白質(zhì)可用于PAGE電泳,、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation,，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等,。

NobleRyder Weak RIPA Lysis Buffer主要由Tris 、NP-40、sodium deoxycholate等組成,，并含有多種蛋白酶抑制劑成分,，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用,。

產(chǎn)品組成：

諾博萊德 RIPA裂解液(弱) 樣本裂解采集

操作步驟(僅供參考)：

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1.取Weak RIPA Lysis Buffer置于室溫溶解混勻,，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM,。

2.去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液,，用PBS,、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次,，低速離心，棄上清,，留取沉淀,。

3.按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例， 加入Weak RIPA Lysis Buffer,。移液器輕輕吹打,，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解,，通常裂解液作用于細(xì)胞1～3s內(nèi),，細(xì)胞就會(huì)被裂解。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠,，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～250μl,。

4.10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī),，室溫下離心亦可),，取上清。

5.后續(xù)的SDS-PAGE,、Western,、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1.取Weak RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻后,，加入PMSF,，使PMSF終濃度為1mM。

2.低速離心懸浮細(xì)胞,，棄上清,，收集沉淀。

3.用手指輕彈細(xì)胞,，使其松散,。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Weak RIPA Lysis Buffer ,。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠,，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～250μl,。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀,。

4.10000～12000g,，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可),，取上清,。

5.進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western,、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

(三)組織樣本

1.取Weak RIPA Lysis Buffer置于室溫溶解混勻后，加入PMSF,，使PMSF終濃度為1mM,。

2.把組zhi剪切成細(xì)小的碎片，越小越好,。

3.取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織,，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控制在1～2min之內(nèi),，以減少蛋白的降解,。

4.按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液,。冰上或4℃裂解15～30min,。

步驟3、4亦可以采用如下過程：按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的Weak RIPA Lysis Buffer,。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,，直至充分裂解，該過程盡量控制在1～2min之內(nèi),，以減少蛋白的降解,。

5.10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī),，室溫下離心亦可),，取上清。

6.進(jìn)行后續(xù)的PAGE,、Western,、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項(xiàng)：

1.去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后,，如果血清中的蛋白沒有干擾,，可以不用清洗。

2.如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品,，可以適當(dāng)減少裂解液的用量,。

3.如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50～100萬細(xì)胞/離心管,，然后再裂解,。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸,，相對(duì)比較容易裂解充分,。

4.如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解,，通過強(qiáng)烈Vortex使樣品裂解充分,。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便,，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分,。

5.溶解NobleRyder RIPA Lysis Buffer時(shí)，應(yīng)盡量縮短溶解時(shí)間,，避免有效成分失效,。

6.裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象,。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下,，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。如果檢測(cè)一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-KB,、p53等時(shí),，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子,。

7.細(xì)胞裂解的操作步驟,，應(yīng)置于冰上或4℃進(jìn)行。

有效期： 12個(gè)月有效,。