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簡介

蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程在臨床診斷和生物技術(shù)行業(yè)中變得越來越重要,，例如在治療藥物監(jiān)測或生物標(biāo)志物檢測中,。特別是基于液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)的分析方法提供了同時(shí)檢測多種分析物的巨大優(yōu)勢(并且是定量的)。蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程傳統(tǒng)上受到LC-MS檢測時(shí)間和樣品制備通量的限制,。而LC-MS設(shè)備技術(shù)和工作流程的進(jìn)步現(xiàn)在顯著增加了可以每周處理的樣本數(shù)量,，瓶頸已經(jīng)轉(zhuǎn)向高效、穩(wěn)健,、可靠的高通量樣本制備,。在本應(yīng)用中，我們演示了一種全自動(dòng)高通量LC-MS樣品制備工作流程,，將Hamilton液體處理技術(shù)與PreOmics iST工作流程相結(jié)合,。

- 節(jié)省時(shí)間和成本，使96孔LC-MS樣品制備的無人值守時(shí)間增加

- 處理1-96個(gè)樣品具有靈活性,，吸頭使用最少

- 標(biāo)準(zhǔn)化工作流程,，具有高數(shù)據(jù)重復(fù)性和過程安全性

流程描述

自動(dòng)化iST工作流程

在Hamilton液體處理平臺(tái)上處理96份樣本的試劑、實(shí)驗(yàn)室器皿和模塊,。每個(gè)步驟都會(huì)顯示設(shè)備上的溫度和運(yùn)行時(shí)間,。根據(jù)樣品材料的不同，溶解條件可能不同,。消化后的肽重新溶解后,，可將96孔板直接載入至LC-MS自動(dòng)進(jìn)樣器中。

應(yīng)用軟件

操作員可通過圖形用戶界面定義每次運(yùn)行的參數(shù),，例如LC-MS之前的消化時(shí)間或再增溶體積,。

試劑盒描述

試劑盒包含使蛋白質(zhì)一步變性、還原和烷基化的專有試劑,，以及進(jìn)行胰蛋白酶消化的酶,。最終肽純化包括兩個(gè)正壓96孔板(iST-REG-PSI 96HT(192個(gè)樣本): P.O. 00108; iST-REG-PSI 96HT(384個(gè)樣本): P.O. 00112)。

技術(shù)

LC-MS樣品制備實(shí)驗(yàn),，如PreOmics iST試劑盒,，在其工作流程中經(jīng)常使用有機(jī)和揮發(fā)性液體,。Hamilton通道中的壓力系統(tǒng)允許通過例如抗懸滴技術(shù)(ADC)對(duì)此類液體進(jìn)行可靠的監(jiān)測和控制。通道中集成的CO-RE（O型圈擠壓擴(kuò)張）技術(shù)允許在不需要額外運(yùn)輸工具的情況下,，往返于臺(tái)面上的每個(gè)模塊,。ODTC與Hamilton PCR Comfort蓋子相結(jié)合，可以高精度,、均勻地控制蛋白質(zhì)消化過程中的溫度,，不會(huì)因蒸發(fā)而導(dǎo)致液體損失。The [MPE]2提供了處理濾板的正壓功能和快速干燥樣品的蒸發(fā)器模塊,，無需離心機(jī),。

結(jié)果

進(jìn)行四項(xiàng)實(shí)驗(yàn)以評(píng)估自動(dòng)化工作流程的重復(fù)性和穩(wěn)定性：

(1) 用釀酒酵母蛋白提取物進(jìn)行交叉污染實(shí)驗(yàn)，表明有在[MPE]2正壓過程及流程中的任何其他步驟中沒有發(fā)生交叉污染,。

(2) 在兩個(gè)不同日期消化來自畢赤酵母和商用人血漿的蛋白質(zhì),，并在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得數(shù)據(jù)。巴斯德畢赤酵母和人血漿中已識(shí)別蛋白的日間重疊率均達(dá)到100% ,。

(3) 按照標(biāo)準(zhǔn)手動(dòng)方案,，消化等份的巴斯德酵母菌樣品。在手動(dòng)日間運(yùn)行中檢測到98%的已識(shí)別蛋白,。

(4) 為檢測完整的96孔板自動(dòng)化運(yùn)行,，處理了48份巴斯德畢赤酵母和48份商用人血漿蛋白提取物的等份試樣。獲得的標(biāo)準(zhǔn)化化蛋白強(qiáng)度表明,，P. pastoris和人血漿的平均相關(guān)性分別為0.97和0.98 ,。

總結(jié)

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和結(jié)果表明，PreOmics iST技術(shù)在Hamilton液體處理平臺(tái)上運(yùn)行很有效,。用戶可以通過自動(dòng)化的標(biāo)準(zhǔn)化和可重復(fù)的工作流程,，最終在不到4小時(shí)的總樣本處理時(shí)間內(nèi)得到LC-MS級(jí)多肽。酵母,、人血漿和腦脊液(CSF) 樣本的成功處理(未顯示)證明了在臨床,、生物技術(shù)和研究環(huán)境中的適用性。