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賽默飛 TRIzol 試劑是一種即用型試劑,，該和 Guanidine isothiocyanate 的單相溶液設(shè)計用于在1小時內(nèi)從人類,、動物、植物,、酵母或細(xì)菌來源的細(xì)胞和組織樣本中提取高質(zhì)量的總RNA（以及DNA和蛋白質(zhì)）,，TRIzol試劑在樣本勻漿化時，可以破壞細(xì)胞,，溶解細(xì)胞組分,，同時高效的抑制RNA酶的活性，從而維持RNA的完整性,。

TRIzol™ 試劑的主要特點包括：

? 可從同一樣品中分離 RNA,、DNA 和蛋白
? 擁有的裂解能力，甚至可處理困難的樣品類型（CN）₂
? 針對組織,、細(xì)胞,、血清、病毒和細(xì)菌進(jìn)行優(yōu)化的配方和方案

從多種樣品體積和來源中可靠純化 RNA
TRIzol™ 試劑可很好地處理少量組織 (50–100 mg) 和細(xì)胞 (5 × 10⁶) 以及大量組織 (≥1 g) 和細(xì)胞 (>10⁷),，且包含用于從人,、動物、植物或細(xì)菌來源的樣品中進(jìn)行純化的方案,。TRIzol™ 試劑通過在樣品均質(zhì)化期間高效抑制 RNase 活性維持 RNA 的完整性,，同時破壞細(xì)胞并溶解細(xì)胞組分。TRIzol™ 試劑方法的簡單性使其可同時處理大量樣品,?？稍诓坏?1 小時的時間內(nèi)完成整個程序。通過 TRIzol™ 試劑分離的總 RNA 不含蛋白和 DNA 污染,。

其配方可分離多種分子靶標(biāo)
TRIzol™ 試劑可使您連續(xù)沉淀單份樣品中的 RNA,、DNA 和蛋白。使用 TRIzol™ 試劑均質(zhì)化樣品后,，加入氯仿,，使勻漿分離成透明的上層水層（含 RNA）、中間相和紅色下層有機(jī)層（含 DNA 和蛋白）,。使用異丙醇從水層中沉淀出 RNA,。使用乙醇從中間相/有機(jī)層中沉淀出 DNA,。通過異丙醇沉淀從-乙醇上清液中沉淀出蛋白。將沉淀出的 RNA,、DNA 或蛋白洗滌以去除雜質(zhì),，然后重懸以用于下游應(yīng)用。

TRIzol 使用必學(xué)小妙招

準(zhǔn)備階段：

1. 確保實驗環(huán)境無核酸酶污染,，可以使用 RNaseZap™ RNase 去污溶液（貨號 AM9780）去除實驗臺表面和非一次性物品,。

2. 實驗過程中，請使用一次性手套和不含核酸酶的一次性槍頭和離心管,，防止引入核酸酶污染,。

3. 準(zhǔn)備好相應(yīng)的實驗材料：

a. 提取 RNA：異丙醇，乙醇（75%）,，0.5% SDS 溶液,。

b. 提取 DNA：乙醇（99%），乙醇（75%）,，0.1 M檸檬酸鈉溶于 10% 乙醇,，8 mM NaOH，HEPES,。

c. 提取蛋白質(zhì)：異丙醇,，乙醇（99%），含 0.3 M 鹽酸胍的 95% 乙醇,，1% SDS 溶液,。

tips

實驗環(huán)境和實驗用品的核酸酶污染是導(dǎo)致 RNA 實驗失敗的重要因素，做好核酸酶清除工作,，使用無核酸酶的實驗用品,，可以讓我們實驗事半功倍哦！

實驗步驟：

裂解樣本

1. 根據(jù)不同樣本材料在 TRIzol 試劑中裂解并勻漿化樣本,。

a. 組織：每 50～100 mg 組織加入 1 mL TRIzol 試劑,，用勻漿儀對樣本進(jìn)行勻漿化。

b. 單層培養(yǎng)細(xì)胞：移除培養(yǎng)基,，每 1×10⁵～10⁷個細(xì)胞加入 0.3～0.4 mL TRIzol 試劑,，反復(fù)吹打勻漿化樣本。

c. 細(xì)胞懸液：離心后棄除上清液,，收集細(xì)胞，每 0.25 mL 樣本加 0.75 mL 的 TRIzol 試劑,，反復(fù)吹打以勻漿化,。

tips

1）在 TRIzol 試劑中可以防止 RNA 降解，故加入 TRIzol 試劑前,，不要洗滌細(xì)胞,。

2）樣本體積不應(yīng)超過用于裂解的 TRIzol 試劑體積的 10%,。

2. 孵育 5 分鐘，隨后每 1 mL TRIzol 試劑添加 0.2 mL 氯仿,，蓋緊蓋子,，劇烈混勻。孵育 2~3 分鐘,。4℃ 下 12,000×g 離心 15 分鐘,。

3. 此時混合物分離成為三層，如下圖,，我們需要將對應(yīng)提取部分吸出進(jìn)行后續(xù)操作,。

tips

Invitrogen™ Phasemaker 分層管（貨號：A33248，A33249）可在 TRIzol 混合物樣品的水相和有機(jī)相間形成一層牢固可靠的膠封,，使科研人員能夠輕松移取 RNA 相,。

RNA 提取

1. RNA 沉淀：取盡上層水相，每 1 mL TRIzol 試劑加 0.5 mL 異丙醇,。4℃ 孵育10分鐘,。4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘。此時底部的白色膠狀沉淀即為總 RNA 沉淀,。棄上清液,。

2. RNA 洗滌：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑，用 1 mL 75% 乙醇重懸沉淀,。瞬時漩渦震蕩,，在 4℃ 下 7,500×g 離心 5 分鐘。棄上清,，RNA 沉淀在空氣中干燥 5～10 分鐘,。

3. RNA 溶解：用 20～50 μL 不含 RNase 的水，0.1 mM EDTA 或 0.5% SDS 溶液,，反復(fù)吹打重懸沉淀,。在 55～60℃ 孵育 10～15 分鐘，然后繼續(xù)下游實驗或者 -70℃ 長期保存,。

tips

1）如果起始樣本很?。? 10⁶ 個細(xì)胞或 < 10 mg 組織），請將 5～10 μg 不含 RNase 的糖原作為載體加入到水相中,，這樣有助于促進(jìn) RNA 沉淀,。

2）如果 RNA 會在隨后的酶促反應(yīng)中使用，則切勿將 RNA 溶解在 0.5% SDS 溶液中,。

DNA 提取

1. DNA 沉淀：棄除上層水相,，剩余相中每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑添加 0.3 mL 99% 乙醇，蓋緊管蓋，反復(fù)顛倒混勻,。孵育 2～3 分鐘,。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘，沉淀 DNA,，移除溶有蛋白質(zhì)的上清液,。

2. DNA 洗滌：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑加 1 mL 含 10% 乙醇的 0.1 M 檸檬酸鈉（pH 8.5）重懸沉淀。孵育 30 分鐘,，偶爾輕輕顛倒混合,。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘，棄上清液,。重復(fù)洗滌步驟一次,。對于 DNA 含量較大的樣本（＞ 200 μg）可以重復(fù)洗滌步驟兩次。每 1 mL 用于裂解的TRIzol試劑加入 1.5～2 mL 75% 乙醇重懸沉淀,，孵育 10～20 分鐘,，偶爾輕輕顛倒混合。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘,，棄上清液,，沉淀風(fēng)干 5～10 分鐘。

3. DNA 溶解：用 0.3～0.6 mL 的 8 mM NaOH 上下吹打重懸沉淀,，4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘,，轉(zhuǎn)移上清至新管子中。加 HEPES 調(diào)整 PH 用于下游應(yīng)用或用 HEPES 和 1 mM EDTA 調(diào)節(jié) PH 至 7～8 長期存儲于 -20℃,。

tips

干燥 DNA 的時候,，不要用真空離心干燥，會影響 DNA 質(zhì)量以及后續(xù) DNA 溶解,。

蛋白質(zhì)提取

1. 蛋白質(zhì)沉淀：棄除上層水相,，剩余相中每 1 mL  用于裂解的 TRIzol 試劑添加 0.3 mL 99% 乙醇，蓋緊管蓋,，反復(fù)顛倒混勻,。孵育 2～3 分鐘。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘,，沉淀 DNA,。上清轉(zhuǎn)移至新管中，每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑加 1.5 mL 異丙醇,，孵育 10 分鐘,。在 4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘，棄上清液,，留蛋白質(zhì)沉淀,。

2. 蛋白質(zhì)洗滌：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑需要加 2 mL 的含 0.3 M 鹽酸胍的 95% 乙醇至沉淀中,，孵育 20 分鐘。在 4℃ 下 7,500×g 離心 5 分鐘,。棄上清液，沉淀在干燥空氣中靜置 5～10 分鐘,。

3. 蛋白質(zhì)溶解：加入 200 μL 1% SDS 溶液,，反復(fù)吹打重懸。4℃ 下 10,000×g 離心 10 分鐘,，將上清轉(zhuǎn)移到新管中,。檢測蛋白質(zhì)濃度并用于下游應(yīng)用或者長期存儲與 -20℃ 中。

tips 

蛋白質(zhì)溶解步驟中的重懸,，在 50℃ 水浴或者金屬浴中孵育,，有助于沉淀重懸充分。