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免疫沉淀中的高背景無(wú)法避免,？

一定要對(duì)樣品溶液進(jìn)行預(yù)清除,？

更高的結(jié)合能力對(duì)免疫沉淀更好？

高質(zhì)量的磁珠價(jià)格昂貴,？

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)想必大家并不陌生,，采用瓊脂糖珠作為介質(zhì)更是免疫沉淀的常用方法。瓊脂糖珠介質(zhì)歷來(lái)有一些難以克服的挑戰(zhàn),，導(dǎo)致人們對(duì)免疫沉淀持有一些并非總是正確的普遍看法,。如何能讓免疫沉淀實(shí)驗(yàn)事半功倍，自然需要對(duì) “四大誤解"有深入了解,。

誤解1：背景是不可避免的

 

要理解這個(gè)“誤解",，首先需要知道什么是背景以及它的來(lái)源。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中的背景是一種額外的非特異性信號(hào),，與抗原或相關(guān)蛋白質(zhì)的質(zhì)量大小不一致,。背景主要由兩個(gè)原因引起：1) 未將上清液與顆粒/樹(shù)脂或珠子清晰分離,；2) 瓊脂糖或 Sepharose 樹(shù)脂的孔隙。當(dāng)使用Sepharose或瓊脂糖樹(shù)脂的混懸液法時(shí),，是沒(méi)有明確沉淀物的,。因此，研究人員可能會(huì)意外地去除過(guò)多的混懸液（和寶貴的樣品）,，或者去除不足,，導(dǎo)致樣品中含有可能提升背景的不需要的蛋白質(zhì)。多孔的Sepharose/瓊脂糖樹(shù)脂會(huì)吸附液體,，以及不需要的蛋白質(zhì),。即使進(jìn)行了多次洗滌，仍然很難去除干擾性蛋白質(zhì),，導(dǎo)致背景較高,。

小貼士：如何減少免疫沉淀中的背景

Dynabeads磁珠可以被磁化，與磁力架一起使用時(shí),，可輕松將其拉到樣品管的一側(cè),。這一特點(diǎn)使得移除緩沖液或上清液變得非常容易，不會(huì)造成任何破壞或樣品損失,。

Dynabeads磁珠的一個(gè)關(guān)鍵特點(diǎn)是其表面清晰,，沒(méi)有孔隙。所有的結(jié)合都發(fā)生在外表面,，從而防止任何不需要的蛋白質(zhì)被困在內(nèi)部,。

為了進(jìn)一步減少免疫沉淀中的背景，建議洗滌含有感興趣蛋白質(zhì)的磁珠,，以去除任何不需要的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段,。

圖1. 用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein A 磁珠與其他供應(yīng)商的對(duì)比。進(jìn)行Western blot來(lái)比較使用1）Sepharose離心柱,、2）Sepharose混懸液、3）瓊脂糖混懸液和離心柱,、4）樹(shù)脂離心柱,、5）Dynabeads Protein A磁珠的方案時(shí)間和背景的差異（每種方法一式兩份）。Dynabeads Protein A磁珠的免疫沉淀具有低背景且至少節(jié)省14分鐘的時(shí)間,。

誤解2：為獲得高質(zhì)量的免疫沉淀結(jié)果,，必須對(duì)樣品溶液進(jìn)行預(yù)清除

 

這個(gè)誤解認(rèn)為，非目標(biāo)蛋白的其他蛋白質(zhì)可能會(huì)與固相發(fā)生非特異性結(jié)合,。為了解決這個(gè)問(wèn)題,，通常會(huì)進(jìn)行預(yù)清除步驟，即將固相（不含抗體）加入樣品中一段時(shí)間,，然后移除,，以去除不需要的非特異性蛋白質(zhì)和背景,。然而，進(jìn)行免疫沉淀的預(yù)清除步驟需要使用雙倍量的固相,，并增加了整個(gè)免疫沉淀方案所需的時(shí)間,。

小貼士：無(wú)需預(yù)清除樣品溶液，即可避免背景干擾

使用 Dynabeads 磁珠與特異性抗體偶聯(lián)后,，無(wú)需預(yù)清除,，因?yàn)樗⒉蛔R(shí)別非特異性蛋白質(zhì)。這種方法不僅節(jié)省了一半的固相使用量,，還減少了實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間,。

圖2. 不進(jìn)行預(yù)清除的Dynabeads  Protein G磁珠與進(jìn)行預(yù)清除的Sepharose Protein G珠之間的背景水平比較。進(jìn)行Western blot來(lái)比較兩種方法的背景水平,，1）進(jìn)行預(yù)清除的Sepharose Protein G珠和2）不進(jìn)行預(yù)清除的Dynabeads Protein G磁珠（每種方法的樣品一式八份）,。結(jié)果顯示，使用Dynabead Protein G磁珠進(jìn)行免疫沉淀能始終沉淀出更多的相關(guān)蛋白,。

誤解3：更高的結(jié)合能力對(duì)免疫沉淀更好

 

這個(gè)誤解是基于瓊脂糖和Sepharose珠子的抗原結(jié)合能力,。瓊脂糖和Sepharose珠子具有外表面和內(nèi)表面，蛋白質(zhì)可以結(jié)合的區(qū)域很大,，從而導(dǎo)致高結(jié)合能力,。這種高結(jié)合能力意味著這些珠子和樹(shù)脂也可以與樣品中的其他蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合。研究人員在選擇IP技術(shù)時(shí)需要在結(jié)合能力,、產(chǎn)量,、特異性和成本之間取得平衡。

小貼士：平衡結(jié)合能力,、產(chǎn)量和特異性

可以使用磁珠,，磁珠外表面與能識(shí)別相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合。由于使用柱式免疫沉淀方法以外的免疫沉淀只需要1-10 µg的抗體,，因此并不需要高結(jié)合能力的試劑,，而且成本效益不高。只需使用實(shí)驗(yàn)所需的確切量即可,，這樣可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)室的抗體,、試劑和免疫沉淀磁珠。

誤解4：高質(zhì)量的磁珠價(jià)格昂貴

 

研究人員可能會(huì)認(rèn)為Dynabeads磁珠價(jià)格昂貴,，而瓊脂糖/ Sepharose混懸液則更具成本效益,。然而，如果考慮到磁珠不需要預(yù)清除步驟,，那么每個(gè)樣品的價(jià)格是相當(dāng)?shù)?，甚至可能更低?/p>

在計(jì)算免疫沉淀的成本時(shí)，研究人員可能會(huì)考慮固相的成本與固定體積固相的結(jié)合能力,。然而,，正如我們?cè)谡`解3中了解到的,，固相的高結(jié)合能力對(duì)于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)并不關(guān)鍵，可能是多余的,，導(dǎo)致使用更多昂貴的抗體,。

小貼士：計(jì)算使用 Dynabeads 磁珠節(jié)省的成本

計(jì)算免疫沉淀成本的正確方法是查看進(jìn)行一次免疫沉淀所需的磁珠和抗體的用量。由于瓊脂糖/ Sepharose混懸液通常需要預(yù)清除,，因此這些珠子的成本必須加倍,。由于Dynabeads磁珠具有較少的非特異性結(jié)合且不需要預(yù)清除，因此在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中使用Dynabeads磁珠比使用瓊脂糖/ Sepharose珠更具成本效益,。

可以說(shuō),，利用磁珠的免疫沉淀技術(shù)的發(fā)展幫助科學(xué)界克服了關(guān)于免疫沉淀的特定誤解，從而為需要優(yōu)化其免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的科學(xué)家提供了支持,。

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