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免疫沉淀中的高背景無法避免？

一定要對樣品溶液進(jìn)行預(yù)清除,？

更高的結(jié)合能力對免疫沉淀更好,？

高質(zhì)量的磁珠價格昂貴？

免疫沉淀實驗想必大家并不陌生,，采用瓊脂糖珠作為介質(zhì)更是免疫沉淀的常用方法,。瓊脂糖珠介質(zhì)歷來有一些難以克服的挑戰(zhàn)，導(dǎo)致人們對免疫沉淀持有一些并非總是正確的普遍看法,。如何能讓免疫沉淀實驗事半功倍,，自然需要對 “四大誤解"有深入了解。

誤解1：背景是不可避免的

 

要理解這個“誤解",，首先需要知道什么是背景以及它的來源,。免疫沉淀實驗中的背景是一種額外的非特異性信號，與抗原或相關(guān)蛋白質(zhì)的質(zhì)量大小不一致,。背景主要由兩個原因引起：1) 未將上清液與顆粒/樹脂或珠子清晰分離,；2) 瓊脂糖或 Sepharose 樹脂的孔隙。當(dāng)使用Sepharose或瓊脂糖樹脂的混懸液法時,，是沒有明確沉淀物的,。因此，研究人員可能會意外地去除過多的混懸液（和寶貴的樣品）,，或者去除不足,，導(dǎo)致樣品中含有可能提升背景的不需要的蛋白質(zhì)。多孔的Sepharose/瓊脂糖樹脂會吸附液體,，以及不需要的蛋白質(zhì),。即使進(jìn)行了多次洗滌，仍然很難去除干擾性蛋白質(zhì),，導(dǎo)致背景較高,。

小貼士：如何減少免疫沉淀中的背景

Dynabeads磁珠可以被磁化,，與磁力架一起使用時，可輕松將其拉到樣品管的一側(cè),。這一特點使得移除緩沖液或上清液變得非常容易,，不會造成任何破壞或樣品損失。

Dynabeads磁珠的一個關(guān)鍵特點是其表面清晰,，沒有孔隙,。所有的結(jié)合都發(fā)生在外表面，從而防止任何不需要的蛋白質(zhì)被困在內(nèi)部,。

為了進(jìn)一步減少免疫沉淀中的背景，建議洗滌含有感興趣蛋白質(zhì)的磁珠,，以去除任何不需要的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段,。

圖1. 用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein A 磁珠與其他供應(yīng)商的對比。進(jìn)行Western blot來比較使用1）Sepharose離心柱,、2）Sepharose混懸液,、3）瓊脂糖混懸液和離心柱、4）樹脂離心柱,、5）Dynabeads Protein A磁珠的方案時間和背景的差異（每種方法一式兩份）,。Dynabeads Protein A磁珠的免疫沉淀具有低背景且至少節(jié)省14分鐘的時間。

誤解2：為獲得高質(zhì)量的免疫沉淀結(jié)果,，必須對樣品溶液進(jìn)行預(yù)清除

 

這個誤解認(rèn)為,，非目標(biāo)蛋白的其他蛋白質(zhì)可能會與固相發(fā)生非特異性結(jié)合。為了解決這個問題,，通常會進(jìn)行預(yù)清除步驟,，即將固相（不含抗體）加入樣品中一段時間，然后移除,，以去除不需要的非特異性蛋白質(zhì)和背景,。然而，進(jìn)行免疫沉淀的預(yù)清除步驟需要使用雙倍量的固相,，并增加了整個免疫沉淀方案所需的時間,。

小貼士：無需預(yù)清除樣品溶液，即可避免背景干擾

使用 Dynabeads 磁珠與特異性抗體偶聯(lián)后,，無需預(yù)清除,，因為它并不識別非特異性蛋白質(zhì)。這種方法不僅節(jié)省了一半的固相使用量,，還減少了實驗所需時間,。

圖2. 不進(jìn)行預(yù)清除的Dynabeads  Protein G磁珠與進(jìn)行預(yù)清除的Sepharose Protein G珠之間的背景水平比較。進(jìn)行Western blot來比較兩種方法的背景水平,，1）進(jìn)行預(yù)清除的Sepharose Protein G珠和2）不進(jìn)行預(yù)清除的Dynabeads Protein G磁珠（每種方法的樣品一式八份）,。結(jié)果顯示,，使用Dynabead Protein G磁珠進(jìn)行免疫沉淀能始終沉淀出更多的相關(guān)蛋白。

誤解3：更高的結(jié)合能力對免疫沉淀更好

 

這個誤解是基于瓊脂糖和Sepharose珠子的抗原結(jié)合能力,。瓊脂糖和Sepharose珠子具有外表面和內(nèi)表面,，蛋白質(zhì)可以結(jié)合的區(qū)域很大，從而導(dǎo)致高結(jié)合能力,。這種高結(jié)合能力意味著這些珠子和樹脂也可以與樣品中的其他蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合,。研究人員在選擇IP技術(shù)時需要在結(jié)合能力、產(chǎn)量,、特異性和成本之間取得平衡,。

小貼士：平衡結(jié)合能力、產(chǎn)量和特異性

可以使用磁珠,，磁珠外表面與能識別相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合,。由于使用柱式免疫沉淀方法以外的免疫沉淀只需要1-10 µg的抗體，因此并不需要高結(jié)合能力的試劑,，而且成本效益不高,。只需使用實驗所需的確切量即可，這樣可以節(jié)省實驗室的抗體,、試劑和免疫沉淀磁珠,。

誤解4：高質(zhì)量的磁珠價格昂貴

 

研究人員可能會認(rèn)為Dynabeads磁珠價格昂貴，而瓊脂糖/ Sepharose混懸液則更具成本效益,。然而,，如果考慮到磁珠不需要預(yù)清除步驟，那么每個樣品的價格是相當(dāng)?shù)?，甚至可能更低?/p>

在計算免疫沉淀的成本時,，研究人員可能會考慮固相的成本與固定體積固相的結(jié)合能力。然而,，正如我們在誤解3中了解到的,，固相的高結(jié)合能力對于免疫沉淀實驗并不關(guān)鍵，可能是多余的,，導(dǎo)致使用更多昂貴的抗體,。

小貼士：計算使用 Dynabeads 磁珠節(jié)省的成本

計算免疫沉淀成本的正確方法是查看進(jìn)行一次免疫沉淀所需的磁珠和抗體的用量。由于瓊脂糖/ Sepharose混懸液通常需要預(yù)清除,，因此這些珠子的成本必須加倍,。由于Dynabeads磁珠具有較少的非特異性結(jié)合且不需要預(yù)清除，因此在免疫沉淀實驗中使用Dynabeads磁珠比使用瓊脂糖/ Sepharose珠更具成本效益,。

可以說,，利用磁珠的免疫沉淀技術(shù)的發(fā)展幫助科學(xué)界克服了關(guān)于免疫沉淀的特定誤解，從而為需要優(yōu)化其免疫沉淀實驗的科學(xué)家提供了支持,。

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