CRISPR 技術(shù)是什么,？
成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相關(guān)蛋白 9 (Cas9) 系統(tǒng)是一種簡(jiǎn)單快速有效的方法,，可直接在細(xì)胞中對(duì)基因序列進(jìn)行更改。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)源自簡(jiǎn)單細(xì)菌免疫系統(tǒng)的組分,，能夠在多種細(xì)胞中進(jìn)行靶向基因切割和基因編輯,。
賽默飛提供CRISPR-Cas9基因編輯產(chǎn)品，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)獲取產(chǎn)品最新信息,。
由于 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)中的核酸內(nèi)切酶切割特異性由 RNA 序列引導(dǎo),，因此通過(guò)對(duì)向?qū)?RNA (gRNA) 序列進(jìn)行工程改造，并將其與 Cas9 核酸內(nèi)切酶一起遞送至靶細(xì)胞內(nèi)后,，幾乎可以對(duì)任何基因組位點(diǎn)進(jìn)行編輯,。
CRISPR-Cas9 系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)高度靈活性和特異性靶向性，可進(jìn)行修飾和重定向,，也已成為干細(xì)胞工程,、基因治療、組織和動(dòng)物疾病模型以及設(shè)計(jì)抗病轉(zhuǎn)基因植物等廣泛應(yīng)用中的強(qiáng)大基因組編輯工具,。賽默飛世爾科技的專家已整合該一系列資源,，您可以放心地開始基因編輯或持續(xù)改進(jìn)您的研究。
CRISPR 是如何工作的,？
CRISPR-Cas9 系統(tǒng)由非編碼短 gRNA 和 Cas9 核酸酶組成（圖 1）,。gRNA 有兩個(gè)分子組分：一個(gè)靶點(diǎn)特異性 CRISPR RNA (crRNA) 和一個(gè)輔助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 單元將 Cas9 蛋白引導(dǎo)至特定基因組位點(diǎn),，Cas9 核酸酶在該位點(diǎn)誘導(dǎo)特定基因組靶序列的雙鏈斷裂（圖 2）,。
圖 1.CRISPR gRNA 和 Cas9 蛋白。
圖 2.CRISPR-Cas9 系統(tǒng),。
在細(xì)菌中,，CRISPR 位點(diǎn)由一系列重復(fù)序列組成，這些重復(fù)序列被 30bp 左右長(zhǎng)度的外源 DNA 間隔開來(lái)，這些外源 DNA 稱為間隔區(qū)序列（spacer）,。重復(fù)-間隔的陣列被轉(zhuǎn)錄為一條較長(zhǎng)的前體RNA,，其中的重復(fù)序列被加工并生成定義了靶標(biāo)序列的短小 crRNA（也稱為前間區(qū)序列（protospacer）） - 靶序列據(jù)此被 Cas9 核酸酶切割。之后人們將CRISPR間隔區(qū)序列作為在DNA水平識(shí)別和沉默外源基因元件的工具,。
重要的是,，緊鄰靶區(qū)域 3'端下游的稱為原型間隔區(qū)相鄰基序 (PAM) 序列的特定三核苷酸序列必須存在才能發(fā)生切割。該 PAM 序列 (Cas9 的 NGG) 存在于靶 DNA 中,，但不存在于靶向該 DNA 的 gRNA 中,。
使用 CRISPR-Cas9 切割 DNA 后，雙鏈斷裂可以通過(guò)兩種細(xì)胞自然修復(fù)機(jī)制之一進(jìn)行修復(fù)（圖 3）,。
1. 在不存在修復(fù)模板的情況下，非同源末端連接(NHEJ) 過(guò)程會(huì)導(dǎo)致 gRNA 定義的斷裂周圍有不同插入或缺失（插入缺失）的異質(zhì)細(xì)胞群,?？衫迷撨^(guò)程在特定序列周圍生成有隨機(jī)缺失的細(xì)胞系，從而獲得功能性敲除,。
2. 或者,，如果提供了修復(fù)模板，則可以通過(guò)無(wú)差錯(cuò)的同源定向修復(fù) (HDR) 機(jī)制,，在基因組內(nèi)的特定位點(diǎn)引入用戶定義的序列變化,。該過(guò)程可用于過(guò)表達(dá)新基因，建立疾病相關(guān)細(xì)胞模型或用可報(bào)告的基團(tuán)標(biāo)記內(nèi)源性基因,。
圖 3.CRISPR-Cas9 雙鏈斷裂和修復(fù)通路,。切割反應(yīng)同時(shí)發(fā)生于兩條鏈中靶序列的3’端 PAM 序列上游 NGG 的 3 個(gè)堿基對(duì)上。
使用 CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的成功秘訣
如果選擇 CRISPR-Cas9 進(jìn)行基因編輯工作流程,，請(qǐng)確保了解使用本系統(tǒng)時(shí)可能會(huì)影響基因組編輯效率的因素,。重要的是要考慮您的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括用于切割的核酸酶形式和 gRNA,，將分子遞送到細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染方法以及檢測(cè)基因編輯以適當(dāng)驗(yàn)證結(jié)果所需的檢測(cè),。
設(shè)計(jì)和構(gòu)建
設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)的關(guān)鍵注意事項(xiàng) ：
? 為每個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和檢測(cè) 3 個(gè) gRNAs
? 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選擇預(yù)測(cè)的脫靶效應(yīng) gRNAs
? 靶向早期組成型外顯子,，破壞基因敲除實(shí)驗(yàn)的閱讀框
? 確保切割位點(diǎn)盡可能接近編輯位點(diǎn),，以進(jìn)行敲入實(shí)驗(yàn)
? 選擇適合實(shí)驗(yàn)的 Cas9 核酸酶
遞送
進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)的關(guān)鍵考慮因素 ：
? 從最佳的細(xì)胞密度和細(xì)胞健康狀態(tài)開始
? 了解轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最佳方法：脂質(zhì)體、電穿孔轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)染
? 優(yōu)化遞送多分子時(shí)的數(shù)量比
? 轉(zhuǎn)染經(jīng)驗(yàn)證的對(duì)照 gRNA,，以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和 Cas9 活性
? 提供修復(fù)模板,，以便在 Cas9 激活時(shí)可進(jìn)行 敲入實(shí)驗(yàn)
檢測(cè)和驗(yàn)證
檢測(cè)編輯時(shí)的主要考慮因素 ：
? 使用基因組切割檢測(cè) (GCD) 試驗(yàn)快速確認(rèn) gRNA 切割效率
? 選擇適合下游應(yīng)用的檢測(cè)方法
? 如果需要遺傳同質(zhì)細(xì)胞群，請(qǐng)分離克隆
? 要知道,，基于插入缺失的敲除的 gRNA 通常是敲入的 gRNA
? 利用靶向測(cè)序驗(yàn)證脫靶編輯
可用的 CRISPR 技術(shù)
賽默飛世爾科技提供一整套基因組編輯試劑（圖 4）,。我們會(huì)根據(jù)您的應(yīng)用和細(xì)胞類型，為這些基因編輯解決方案匹配最佳的細(xì)胞培養(yǎng)試劑、遞送方法以及分析工具,。
圖 4.可用的 CRISPR-Cas9 核酸酶和 gRNA 形式,。
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