PCR程序設置和什么有關,？影響大么？

一旦確定了合適的DNA起始量和PCR組分,，就必須設定PCR循環(huán)和運行參數(shù),，從而確保高效擴增,。

DNA聚合酶的特點,、PCR緩沖液的類型、模板DNA的復雜程度都會影響反應條件的設置,。

1,、起始高溫變性步驟

在PCR起始階段，通常是在94–98℃下孵育1-3min將雙鏈DNA模板解離成單鏈,，從而使引物可與目標區(qū)域結合并開始延伸,。

此步的高溫條件使起始DNA變性,，確保在第一個擴增循環(huán)期間實現(xiàn)有效的目標序列擴增，此外也有助于使樣品中可能存在的熱不穩(wěn)定性蛋白酶或核酸酶失活,，從而保證它們極小影響熱穩(wěn)定性DNA聚合酶,。

同時，當使用熱啟動DNA聚合酶時,，此步同時可以激活該聚合酶,。

起始變性步驟,，該步驟的時間和溫度取決于模板DNA的性質和緩沖液的鹽濃度。

例如,，哺乳動物基因組DNA可能比質粒和PCR產(chǎn)物需要更長的孵育時間（具體取決于DNA的復雜程度和大?。?/p>

同樣，高GC含量（如,， >65%）的DNA通常需要更長的孵育時間或更高的溫度,。高鹽濃度的緩沖液（滿足某些DNA聚合酶的需要）同樣需要更高的變性溫度（如，98℃）,，以使雙鏈DNA解離,。

在95℃以上長時間孵育，很容易使Taq DNA聚合酶等DNA聚合酶變性,。為彌補在該步驟中酶損失的活性,，可能需要在起始變性步驟后添加更多的酶，或在一開始加入多于建議用量的DNA聚合酶。高度熱穩(wěn)定的酶(如來自Archaea的酶)能夠耐受長時間高溫孵育,，在整個PCR過程中保持活性,。

2、循環(huán)變性步驟

起始變性步驟后,，后續(xù)PCR循環(huán)以一個獨立的變性步驟開始,，并在94–98℃條件下持續(xù)0.5-2min。

與起始模板DNA變性步驟一樣,，該步驟的時間和溫度也可根據(jù)模板DNA,、DNA聚合酶和緩沖液成分的性質進行優(yōu)化。

例如，更長時間和/或高溫條件對長片段和/或富含GC的目的片段可能是有利的,。

甘油,、DMSO、甲酰胺和甜菜堿等添加劑的存在,，可促進變性步驟期間雙鏈DNA的解離并提高特異性,，從而無需長時間或高溫條件。

3、引物退火步驟

在該步驟中,，目的是降低反應溫度,，使引物與目標DNA結合。

通常，0.5-2min的孵育時間足以供引物完成退火,。通過計算PCR擴增引物的熔解溫度（Tm）,，可確定退火溫度。根據(jù)一般經(jīng)驗法則,，起始退火溫度比引物低至Tm低3–5℃。

Tm指50%的引物與其互補序列形成雙鏈時的溫度,，可通過多種方法進行計算,。引物Tm估算簡單的方法是利用DNA寡核苷酸中的核苷酸數(shù)量進行計算，公式如下：Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T),。

由于反應的鹽濃度 (Na?) 會影響引物退火，因此,，使用以下公式能夠更加準確地計算Tm：Tm=81.5+16.6(log[Na?]) + 0.41(%GC)–675/引物長度,。

Tm計算需考慮的一個重要因素是PCR添加劑、輔助溶劑和修飾核苷酸的使用,。這些試劑的存在會降低引物-模板復合物的Tm,。

例如，10%DMSO會使退火溫度降低5.5–6.0℃,。同樣,，在PCR中使用7-deaza-dGTP取代dGTP也會降低Tm。此時,，應相應調整退火溫度,。

7-Deaza-dGTP是一種人工合成的dGTP類似物，可作為大多數(shù)DNA聚合酶(包括Taq DNA Polymerase)的底物,。

與dGTP相比,，7-Deaza-dGTP具有更高的電子親和力化學穩(wěn)定性,，這使得它在DNA合成反應中更容易被酶識別和嵌入，從而提高了DNA合成的效率和準確性,。7-Deaza-dGTP摻入DNA后可影響DNA的熒光染色和電泳遷移率,；與dITP相比，7-Deaza-dGTP提升了長序列區(qū)域的易讀性,。

7-Deaza-dGTP替代或部分替代dGTP擴增富含GC的DNA序列,，可提升有效降低PCR反應錯誤率,，提高PCR產(chǎn)物產(chǎn)量，使DNA測序更加簡單高效,，廣泛應用于富含GC的DNA序列的PCR擴增,、測序和基因克隆等生物實驗，在疾病診斷中發(fā)揮重要作用,。

應注意,，計算所得 Tm 值就是引物退火的起始參考溫度。退火溫度可能需要根據(jù)擴增結果進行進一步優(yōu)化,。

例如,，如果結果為無擴增條帶或擴增水平很低，則優(yōu)化時應以2–3℃增量逐漸降低退火溫度,。但是,，如果出現(xiàn)非特異性PCR產(chǎn)物,，則以2–3℃增量逐漸提高溫度（最高至延伸溫度），提高特異性,。

4,、引物延伸步驟

引物退火后,，便是延伸引物的3'末端，產(chǎn)生模板的互補鏈,。該步中,，DNA聚合酶的5'→ 3'聚合酶活性引入dNTP并合成子鏈。

反應溫度升高至酶的最佳溫度（熱穩(wěn)定DNA聚合酶的最佳溫度通常為70–75℃），使其達到最高活性,。

如果引物退火溫度與延伸溫度相差不超過3℃,，則退火和延伸溫度可合并為一步，稱為兩步PCR法,。兩步PCR法無需在退火和延伸之間轉換和穩(wěn)定溫度,，從而縮短了PCR所需的時間。

PCR的延伸時間取決于DNA聚合酶的合成速度以及目標DNA的長度。

Taq DNA聚合酶的一般延伸時間是1min/kb,，而 Pfu DNA聚合酶為2min/kb,。因此，“緩慢型"聚合酶比“快速型"聚合酶需要更多的擴增時間,，才能獲得相等的得率,。

同樣,，長DNA擴增子比短DNA需要更長的延伸時間，才能實現(xiàn)全長復制,。當擴增長目的片段（如,， >10 kb）時，除了需要增加延伸時間,，還需要降低PCR溫度,，以確保引物結合并在長時間循環(huán)中維持酶活性。

5,、PCR循環(huán)數(shù)設置

為擴增目標DNA,，需重復PCR的變性、退火和延伸步驟多次,。循環(huán)數(shù)通常為25-35次,，具體取決于DNA起始量和所需的目標PCR產(chǎn)物得率。

如果DNA起始量少于10拷貝數(shù)，則可能需要多達40個循環(huán),，才可獲得足夠的得率,。不建議使用超過45個循環(huán)，因為過多的循環(huán)數(shù)會產(chǎn)生非特異性條帶,。而且,，副產(chǎn)物的累積和反應組分的消耗會大大降低PCR效率，使PCR擴增曲線出現(xiàn)平臺期,。

相反,，較少的循環(huán)數(shù)更適合于無偏倚擴增（如下一代測序）以及目標DNA的準確復制（如克?。?/p>

6,、最終延伸步驟

最后一個PCR循環(huán)完成后,，即為最終延伸步驟。該步中,，將PCR混合物在延伸溫度（通常為72℃）下最后孵育5-15min,。其持續(xù)時間取決于擴增子長度和組成，以確保全長復制以及高目標DNA片段得率,。

在該步驟中,，除了填補不完整末端外,，Taq DNA 聚合酶等具有末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）活性的DNA聚合酶還會在PCR引物的3'末端添加額外的核苷酸。

因此，如果PCR擴增子被克隆到TA載體中,，建議最終的延伸步驟持續(xù)30min,，以確保生成合適的3'-dA尾部結構以實現(xiàn)有效的PCR克隆。

參考文獻：

［1］PCR循環(huán)參數(shù)—成功的六大關鍵因素-賽默飛

［2］7-Deaza-dGTP (10mM, for GC-Rich PCR/Sequencing)-碧云天

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