疫苗的開發(fā),，從研發(fā)到早期臨床前研究再到商業(yè)化生產(chǎn),、檢測和批次放行，涉及大量的分析與檢測以保證疫苗產(chǎn)品的有效性和安全性,。疫苗開發(fā)過程中的生物分析面臨著樣品基質(zhì),、分析物類型以及工作流程效率等方面的挑戰(zhàn)，例如用于分析的疫苗樣本差別很大,，分析物的范圍很廣,，包括多糖、蛋白質(zhì)和多肽等,，這些都必須在不同的基質(zhì)中進(jìn)行檢測,。此外，新一代疫苗涉及越來越多的抗原，例如HPV(人乳頭瘤病毒)疫苗有二價,、四價和九價等多種類型,，這又大大增加了檢測的復(fù)雜性。免疫分析法通常用來測定疫苗的滴度,、純度和效力,，以及它們在動物和人體中的免疫原性反應(yīng)等，基于多孔板的ELISA免疫分析已經(jīng)成為疫苗生物分析中的黃金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一,，包括定量抗原表位,、評估雜質(zhì)水平和監(jiān)測疫苗開發(fā)中的滴度和免疫原性等。然而,，日益緊迫的項(xiàng)目時間表促使研究人員開始尋求疫苗免疫分析性能的改進(jìn),，包括：
使用更少量的珍貴試劑如疫苗候選分子，以及來自小型實(shí)驗(yàn)動物的樣本
檢測方法可以方便地處理血清和血漿,、含鋁佐劑和油乳佐劑的樣品
減少動手操作的時間
減少檢測方法的開發(fā)時間
Gyrolab® 系統(tǒng)為這些需求提供了一個解決方案,，并在疫苗開發(fā)中提供了許多額外的獲益。Gyrolab開放的平臺支持對各種分析物,、樣品類型和配方進(jìn)行快速的檢測開發(fā),，并為多種應(yīng)用提供即用型試劑盒。Gyrolab在Bioaffy™ 微流控CD中進(jìn)行納升級的免疫檢測,，最大限度地減少了來自多種基質(zhì)的干擾,，而且樣品和試劑消耗量很小，可以滿足最新一代疫苗和小型實(shí)驗(yàn)動物試驗(yàn)的需要,；高通量和自動化模式對多個分析物進(jìn)行并行分析,，大大減少了動手時間，可以快速提供數(shù)據(jù),，滿足具有挑戰(zhàn)性的項(xiàng)目時間表和更快的決策。Gyrolab軟件工作站符合21 CFR 第11部分要求,，其開發(fā)的檢測方法及數(shù)據(jù)滿足監(jiān)管環(huán)境要求,，并能在制藥廠和CRO之間順利轉(zhuǎn)移。
本文介紹了幾個使用Gyrolab系統(tǒng)提高疫苗研發(fā)性能和效率的應(yīng)用案例,，以說明Gyrolab系統(tǒng)在實(shí)際使用中的優(yōu)勢,。
案例1：在1.5小時內(nèi)檢測血清中的抗原特異性抗體
檢測接種疫苗的受試者的記憶B細(xì)胞(MBC)產(chǎn)生的抗體的數(shù)量和質(zhì)量是了解如何誘導(dǎo)終身性保護(hù)性抗體的關(guān)鍵。人外周血抗原特異性記憶B細(xì)胞的相對頻率一般通過連續(xù)有限稀釋法(serial limiting dilution assay, sLDA)和ELISA分析細(xì)胞培養(yǎng)上清液來確定,，但這種方法費(fèi)時費(fèi)力且耗費(fèi)大量實(shí)驗(yàn)材料,，因此，諾華公司的疫苗和診斷開發(fā)研究人員將ELISA免疫測定法轉(zhuǎn)移到Gyrolab系統(tǒng)上以提高產(chǎn)量,。該研究的目標(biāo)是將奈瑟氏菌抗原 (Neisseria) 與三種佐劑組合后接種小鼠,，通過免疫檢測確定小鼠記憶B細(xì)胞所產(chǎn)生的IgG亞型。研究人員測試了兩種檢測形式：
直接檢測 (Direct Assay)，
用于評估：①生物素化抗原與Gyrolab Bioaffy微流控CD中鏈霉素親和柱結(jié)合并捕獲特異性IgG的能力,；②檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗原特異性抗體的靈敏度,；③通過Gyrolab Viewer中的結(jié)合曲線，評估抗體與特定抗原結(jié)合的親和力,。
反向檢測(Reverse Assay),，
用于評估Alexa熒光標(biāo)記的抗原檢測與CD親和柱結(jié)合的特異性IgG的能力。
Direct Assay
Reverse Assay 圖1. Gyrolab檢測和ELISA在接種奈瑟式菌的受試小鼠B細(xì)胞培養(yǎng)上清液中鑒定出相同的陽性和陰性樣本,。Y軸為Gyrolab檢測的抗體滴度,，ELISA鑒定的陽性樣本以綠色框標(biāo)記。
圖2. Gyrolab直接檢測法能夠在幾微升的樣品中同時檢測屬于不同IgG亞型的抗體,。
與ELISA相比,，在Gyrolab系統(tǒng)上進(jìn)行抗原特異性抗體檢測有很多優(yōu)勢，僅需幾微升的樣品就能分析抗體反應(yīng)的質(zhì)量,，即IgG亞型的相對數(shù)量,。
案例2：試劑篩選—用于放行檢測的疫苗批次比較
多價疫苗的生物分析越來越復(fù)雜，需要開發(fā)大量的檢測方法,。因?yàn)槎鄡r疫苗包含多個抗原,，必須為每個抗原成分開發(fā)放行檢測方法以確保劑量和效力，所以每個產(chǎn)品的檢測數(shù)量要乘以抗原的數(shù)量,。美國默克公司的疫苗分析開發(fā)小組開發(fā)了一種高度靈活的Gyrolab檢測方法,，可以最大限度地減少多價疫苗檢測方法的開發(fā)和試劑消耗 (如標(biāo)記的檢測抗體等)。該方法是基于固定在Gyrolab Bioaffy CD的鏈霉親和柱上的生物素化山羊抗小鼠IgG,，加入分析物特異性捕獲抗體(如小鼠α-PS mAb)之后再加入樣品,，然后用第二個分析物特異性抗體(如兔α-PS pAb)檢測被捕獲的分析物，最后用Alexa Fluor® 647標(biāo)記的驢抗兔抗體進(jìn)行熒光檢測(圖3),。這種5層“雙夾心”檢測形式無需標(biāo)記針對特定分析物的試劑,，分析物特異性試劑可以很容易地被替代，所以只需要最少的開發(fā)就可以應(yīng)用于多價多糖和多價蛋白質(zhì)疫苗的檢測以及抗血清的批次間差異,。
圖3. 5層“雙夾心”Gyrolab檢測形式,。PS：多糖分析物
Gyrolab檢測法被用來比較針對三種抗原測試的兩個抗血清批次。使用Gyrolab Viewer軟件模塊可以將CD微通道中親和柱上每個數(shù)據(jù)點(diǎn)的結(jié)合反應(yīng)可視化,，這使得數(shù)據(jù)可以與更費(fèi)時的效力曲線相媲美 (圖4),。
圖4. Panel A：使用熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù) (左) 和反應(yīng)曲線 (右) 對抗原A、B和C的抗血清批次進(jìn)行比較,。Panel B：抗原B的Gyrolab Viewer結(jié)合強(qiáng)度曲線圖像,，顯示新批次的柱上熒光強(qiáng)度較低，峰拖尾增加,，表明該批次的抗體親和力比老批次低,。
雖然兩個批次對抗原A的表現(xiàn)相似,，但舊批次對抗原B的表現(xiàn)更好，在Gyrolab Viewer中結(jié)合譜圖的峰面積更大,，滴定時信噪比更高,。新的批次顯示出明顯的柱上熒光拖尾，這表明與抗原的親和力較低,。對于抗原C,，兩個批次的抗血清都顯示出明顯的拖尾現(xiàn)象，舊批次的抗血清顯示出更多的峰拖尾,。滴定時,，舊批次的背景較高，信噪比較低,。因此,，Gyrolab Viewer的可視化結(jié)合譜圖、反應(yīng)曲線和信噪比相結(jié)合為了解抗血清批次提供了寶貴的意見,。
默克公司的團(tuán)隊得出結(jié)論,，Gyrolab系統(tǒng)提供了有價值的統(tǒng)計和圖形數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)在一起評估時與基于多孔板的檢測數(shù)據(jù)一致,，還有快速周轉(zhuǎn)時間,、高通量和可視化結(jié)合強(qiáng)度的能力等額外獲益。
案例3：抗原滴度定量動態(tài)范圍擴(kuò)大到4 logs
疫苗開發(fā)公司需要擴(kuò)大免疫測定的動態(tài)范圍,，以測量吸附在鋁佐劑上的糖蛋白抗原,。研究人員將ELISA轉(zhuǎn)移到Gyrolab系統(tǒng)上，將動態(tài)范圍從5-300 mIU/mL擴(kuò)展到~0.6-40 000 mIU/mL,，Gyrolab檢測同時擴(kuò)展了定量的上限和下限,。
圖5. Gyrolab提供了一種強(qiáng)大的檢測方法，在測量抗原滴度時極大地擴(kuò)展了動態(tài)范圍,。
案例4：支持配方開發(fā)的疫苗效力試驗(yàn)
評估批次間效力的一致性是疫苗質(zhì)量控制的一個重要組成部分,。效力試驗(yàn)可用于穩(wěn)定性研究、發(fā)酵和純化工藝的驗(yàn)證與優(yōu)化,、比較新舊設(shè)施設(shè)施以及評估配方或佐劑變更的效果,。
美國默克公司比較了Gyrolab系統(tǒng)與Luminex檢測法在小鼠效力試驗(yàn)中的表現(xiàn)。該研究涉及小鼠體內(nèi)免疫,，將正常化的抗原樣品稀釋到6-12個劑量濃度范圍,。有效劑量 (ED50) 是根據(jù)每個給藥組中50%的小鼠血清轉(zhuǎn)化的最大劑量來確定的,，獲得一個ED50值需要多達(dá)220個小鼠血清樣本，因此這項(xiàng)繁瑣的工作需要大量的小量樣本,。Gyrolab檢測被證明是可靠和穩(wěn)健的,，其靈敏度和重現(xiàn)性 (CV<10%) 可與Luminex測定相媲美 (R2 = 0.97),，但操作時間更短，周轉(zhuǎn)時間更快,。
圖6. Gyrolab檢測具有高度可重復(fù)性,，CV<10%
圖7. Gyrolab和Luminex的免疫檢測給出的結(jié)果具有可比性
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